大米蛋白ACE抑制肽制備及其膜高效分離技術的研究.pdf

1、相對于其它植物蛋白，大米蛋白具有很高的營養(yǎng)價值，但對于慢性腎臟病人來說仍然是一大負擔，中恩（天津）醫(yī)藥科技有限公司擬開發(fā)一款脫蛋白大米，以滿足腎臟病人對大米的需求并減輕他們的腎臟負擔。本實驗的主旨在于將脫除的大米蛋白回收，建立起高效的超濾回收方法，生產具有血管緊張素轉換酶（ACE）抑制功效的大米蛋白肽。
　　首先選擇了兩株芽孢桿菌與原工藝生產使用的乳酸菌2-18作脫除蛋白的效果對比，實驗結果表明芽孢桿菌Y、Y4-2和乳酸菌都能在大

2、米里面生長達到108CFU/mL，并且產生蛋白酶，但是乳酸菌2-18脫蛋白能力要明顯優(yōu)于兩株芽孢桿菌；將三株菌與胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶進行組合實驗，結果顯示乳酸菌2-18與胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶的組合蛋白脫除率最高達到91％。
　　回收液得到的肽液，經過經過過濾、微濾除去固形顆粒物和菌體等雜質后，測定了其基本組成成分，全蛋白、肽含量分別為0.66%±0.026%、0.63%±0.035%，灰分含量為7.3±0.096mg/

3、10mL，透析后降到1±0.035mg/10mL。氨基酸分析顯示，必需氨基酸占總氨基酸含量的39.62%，其SRC為91.05，遠高于豬牛肉的SRC；通過分子量分布分析，肽的分子量主要在1000Da~1500Da之間，占總量的41.66%，在這個分子量范圍的肽可能具有ACE抑制活性；然后測定了ACE抑制率，經過乳酸菌2-18、胃蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解后肽的ACE抑制率達到91.95%±6.45%；通過模擬胃腸消化，在胃腸中肽會有部分水解

4、，且ACE抑制率下降。
　　由肽分子量分布結果，本研究預選1kDa、3kDa的超濾膜，1kDa的超濾膜的截留率為89.29%，遠大于3kDa的超濾膜的65.69%；通過對壓力、溫度、物料濃度對膜通量的影響的探究，選擇溫度低、高水平40℃、50℃，壓力低、高水平0.3MPa、0.4MPa，物料濃度低、高水平0.31%、0.63%進行Box-Behnken設計，確定的超濾的優(yōu)化模型為：Y=30.92+2.56·A+4.7·B-0.58

5、·C+0.9·A·B+0.0025·A·C+0.11·B·C-1.42·A2-1.22·B2-0.54·C2，方差分析和響應面分析表明：溫度、壓力對膜通量的影響極顯著，而物料濃度、溫度和壓力的交互作用對膜通量的影響顯著。用Design Expert軟件對超濾條件進行優(yōu)化，結合實際生產成本考量本研究選擇超濾條件為50℃、0.4MPa和0.63%，該條件下理論值為35.43L/(h·m2)，實際測得膜通量為35.54±0.70L/(h·m2

6、)；研究表明超濾膜的使用超濾周期為150min較好，反向清洗壓力為0.2MPa，清洗時間為10min，這樣能保持較好的膜通透性。
　　陽離子交換柱層析初步將肽液分離純化成三個組分：AⅠ、AⅡ、AⅢ，經過Superdex peptide10/300GL凝膠過濾柱層析，將組分AⅠ分離純化為七個組分：BⅠ、BⅡ、BⅢ、BⅣ、BⅤ、BⅥ、BⅦ，經過RE-HPLC的分離純化，組分BⅤ被進一步分離純化為CⅠ和CⅡ，對CⅠ進行了LC/MS和氨基