豬鏈球菌2型感染宿主后宿主表達(dá)譜的分析研究.pdf

1、豬鏈球菌病是由豬鏈球菌(Streptococcus suis)引起的一種重要的細(xì)菌性傳染病,屬國家規(guī)定的二類動物疫病。豬鏈球菌屬于革蘭氏陽性菌,目前根據(jù)莢膜多糖(CPS)可將豬鏈球菌分為33個血清型。其中豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype2,SS2)流行最廣、致病力最強,是一種重要的人畜共患傳染病,能引起包括人和豬在內(nèi)的多種動物的多種疾病,造成感染甚至死亡,嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展和人類健康。感染豬鏈球菌2

2、型菌能引起豬的敗血癥、腦膜炎、肺炎等病變,并造成突然死亡。人通過接觸病死豬及其副產(chǎn)品經(jīng)傷口、消化道感染豬鏈球菌2型,可引起人鏈球菌中毒休克綜合癥(STSS)和鏈球菌腦膜炎綜合癥(SMS),導(dǎo)致腦膜炎、敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎、永久性耳聾及突發(fā)性死亡等,死亡率高。1998年夏季,在我國江蘇省部分地區(qū)爆發(fā)了人感染豬鏈球菌病造成14人死亡；2005年夏季,在四川省的大爆發(fā),造成204人發(fā)病38人死亡,引起了全球?qū)残l(wèi)生的關(guān)注。
　　

3、敗血癥是SS2感染的常見的癥狀,并且能引起高死亡率。研究發(fā)現(xiàn)SS2可以天然寄居在扁桃體中而不發(fā)病,但是在一定的條件下SS2進入血液,被單核細(xì)胞吞噬或單獨存在血液中,通過脈絡(luò)叢運送到腦脊液(CSF)中,激發(fā)單核細(xì)胞或吞噬細(xì)胞產(chǎn)生高水平的細(xì)胞因子和趨化因子,導(dǎo)致該部位的炎癥反應(yīng)和腦膜炎。為了研究SS2感染宿主后與宿主單核細(xì)胞的相互作用,本研究選擇人單核細(xì)胞FHP-1細(xì)胞,采用基因芯片的方法研究SS2感染對人THP-1細(xì)胞的基因表達(dá)譜的變化。

4、
　　 由于SS2感染豬和人之后主要導(dǎo)致腦膜炎、肺炎以及敗血癥等病理變化,為了深入了解其致病機制,本實驗選擇人工感染SS2的豬腦組織、肺組織以及外周血單核淋巴細(xì)胞(PBMC)為研究對象,采用基因芯片的方法研究SS2感染后其基因表達(dá)譜的變化,為進一步研究感染機制和致病機理提供依據(jù)。具體內(nèi)容如下:
　　 1.人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞感染SS2后表達(dá)譜的變化用SS2感染THP-1細(xì)胞3h,收集對照組和實驗組THP-1細(xì)胞,提

5、取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后在體外(IVT)合成cRNA,將cRNA片段化后與AffymetrixGenChip@系列的Human Genome U133 plus2.0基因芯片進行雜交,通過洗片、掃描得到表達(dá)譜芯片的各探針的信號值。通過分析,得到感染了SS2的THP—1細(xì)胞的各個基因,相比較沒感染SS2的THP-1對照細(xì)胞,基因的表達(dá)量是否發(fā)生了變化,以及變化的倍數(shù)(Fold Change,FC)。本實驗以p-value小于或等

6、于0.05且FC大于或等于2的基因為上調(diào),p-value小于或等于0.05且FC小于或等于-2的基因為下調(diào)。經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析,在此芯片中包含的38500個人的基因中,有2021個轉(zhuǎn)錄本p-value小于或等于0.05,篩選出386個轉(zhuǎn)錄本有顯著性差異表達(dá)變化的基因,通過DAVID在線軟件分析,根據(jù)Gene Ontology(GO)的注釋,328個基因是已知的,包括了230個上調(diào)基因和98個下調(diào)基因。
　　 通過對這些基因進行Gen

7、e Ontology生物學(xué)過程(Biological process)分類,差異表達(dá)基因較多地參與下述生物學(xué)過程:翻譯(Translation)、細(xì)胞因子(Chemokine)、防御/免疫反應(yīng)(Defese/immunity)、泛素.蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasomesystem)、細(xì)胞分裂(Cell division)、凋亡(Apoptosis)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、代謝(metab

8、olism)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction)、轉(zhuǎn)錄(Transcription)及代謝(Metabolism)等。
　　 利用STRING在線軟件分析這些差異表達(dá)基因合成的蛋白之間的功能關(guān)系,并對一些蛋白之間的關(guān)系進行預(yù)測。我們篩選出以INSR、BCL2、CTNNB、UBE2D1和TIF2為中心的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,主要圍繞在NF-kappa-B信號通路及其他免疫反應(yīng)途徑相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。
　　 進一步用實時

9、熒光定量PCR方法對其中5個相關(guān)基因:同源盒基因(homeoboxA4,HOXA4)、CC類趨化因子受體8(chemokine(C-C motif)receptor8,CCR8)、羧肽酶O(carboxypeptidase O,CPO)、RNA聚合酶Ⅱ亞單位2(RNA polymeraseⅡsubunit2,POLR2B)、丙酮酸脫氫酶Elα亞單位基因(pyruvate dehydrogenase(lipoamide)alpha1,PD

10、HA1)、Janus激酶1(Janus kinase1,JAK1)的表達(dá)差異進行了驗證,得出HOXA4、CCR8、CPO分別上調(diào)2.56、32.94和30.96倍,POLR2B、PDHA1為無變化的0.87和0.76倍,JAK1則下調(diào)0.48倍。而Human Genome U133 plus表達(dá)譜芯片篩出的這幾個差異表達(dá)基因分別為7.297、7.775、10.52、1、1和0.477倍,與Realtime PCR的結(jié)果基本保持一致。

11、r>　　 2.人工感染SS2的豬腦組織、肺組織及外周血單核淋巴細(xì)胞的表達(dá)譜變化用SS2感染仔豬,24小時后宰殺,取得對照組和實驗組仔豬的腦組織、肺組織及全血分離獲得的PBMC。提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后在體外(IVT)合成cRNA,將cRNA片段化后與Affymetrix GenChip@系列的Porcine Genome基因芯片進行雜交,通過洗片、掃描得到表達(dá)譜芯片的各探針的信號值,通過分析得到感染了SS2的豬的腦、肺及P

12、BMC,相比較沒感染SS2的腦、肺及PBMC,基因的表達(dá)量是否發(fā)生了變化,以及變化的倍數(shù)(Fold Change,FC)。本實驗以p-value小于或等于0.05且FC大于或等于2的基因為上調(diào),p-value小于或等于0.05且FC小于或等于-2的基因為下調(diào)。經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析,在此芯片中包含的20201個豬的基因中,腦組織中總共檢測到1608個有顯著性差異表達(dá)變化的基因,包含了344個上調(diào)和1264個下調(diào)。肺組織中檢測到617個有顯著性差

13、異表達(dá)變化的基因,包括293個上調(diào)和324個下調(diào)。PBMC中共檢測到685個有顯著性差異表達(dá)變化的基因,包括403個上調(diào)和282個下調(diào)。在3個組織中均有有顯著性差異表達(dá)變化的基因有31個,包括了26個上調(diào)基因和5個下調(diào)基因。
　　 利用DAVID(Visualization and Integrated Discovery)在線軟件分析,共檢測到腦中417個已知的基因。在肺中共檢測到210個已知的基因,在PBMC中檢測到213個

14、已知的基因。將這些檢測到的基因進行分類,可以知道差異表達(dá)基因主要集中在以下幾個類別,包括:防御反應(yīng)(defence response)、免疫反應(yīng)(immune response)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)、天然免疫(innate immune rsponse)、細(xì)胞粘附(cell adhesion)、細(xì)胞死亡(cell death)、細(xì)胞分化(cell differentiation)、與信號傳導(dǎo)關(guān)聯(lián)的細(xì)胞

15、表面受體(cell surface receptor linked signal transduction)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、細(xì)胞因子結(jié)合(cytokine binding)、對外界刺激的反應(yīng)(response to external stimuli)、對刺激的反應(yīng)(response to stimulus)、應(yīng)激反應(yīng)(response to stress)、創(chuàng)傷反應(yīng)(response to woun

16、ding)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性(signaltransducer activity)、基因表達(dá)(gene expression)和生長因子活性(growth factoractivity)。
　　 進一步用實時熒光定量PCR方法對其中5個相關(guān)基因:ICAM-1、TLR2、CD163、TTR、VEGFA的表達(dá)差異進行了驗證。得到結(jié)果ICAM-1、TLR2、CD163在腦中上調(diào)表達(dá)6.00、19.89、179.61倍,TTR和VEGFA下

17、調(diào)-10.92和-4.205倍,而PorcineGenome表達(dá)譜芯片篩出的這幾個差異表達(dá)基因分別為5.77、3.86、8.91、-12.83和1.55倍。在肺中,上調(diào)基因ICAM-1、TLR2、CD163的表達(dá)分別為55.50、25.59和11.30倍,TTR和VEGFA下調(diào)-7.69和-3.45倍,而表達(dá)譜芯片篩出的這幾個基因分別為1.97、2.44、4.25、-1.05和-2.22倍。在PBMC中,ICAM-1、TLR2、CD16