miR-370在小鼠發(fā)育中的表達(dá)機(jī)制及其對(duì)發(fā)育的影響.pdf

1、microRNA（miRNA）是高度保守的小分子非編碼 RNA，通過對(duì)靶向基因的負(fù)調(diào)控作用參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、胚胎發(fā)育等生命過程。miR-370是一個(gè)高度保守的父本印記基因，位于小鼠12號(hào)染色體遠(yuǎn)端Dlk1-Dio3印記區(qū)內(nèi)長非編碼RNA Rian的第3內(nèi)含子中，同源定位于人14號(hào)染色體DLK1-DIO3印記域。研究顯示Dlk1-Dio3印記區(qū)間不僅與干細(xì)胞多能性關(guān)系密切，而且與人類和小鼠的多種遺傳

2、缺陷，發(fā)育遲緩、代謝紊亂等有關(guān)。miR-370作為該基因簇中印記miRNA的一員，在小鼠胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)模式及其對(duì)胚胎發(fā)育的影響和功能并不清楚，因此本論文以miR-370為研究對(duì)象，利用實(shí)時(shí)定量PCR和原位雜交的技術(shù)確認(rèn)其在正常小鼠胚期發(fā)育過程中的表達(dá)模式；通過生物信息學(xué)分析和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)篩選和鑒定其靶基因；并通過構(gòu)建過表達(dá)小鼠模型，驗(yàn)證活體中miR-370對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)控作用，探索轉(zhuǎn)基因小鼠的表型異常與miR-370富集的潛在

3、關(guān)系，初步闡述miR-370的潛在功能。
　　首先，在不同細(xì)胞中的定量分析結(jié)果顯示，在鼠源的14株細(xì)胞系中， miR-370在AtT20、MLTC-1及F93株腫瘤細(xì)胞中表達(dá)較高，而在正常永生細(xì)胞株—TM3、MS5和NIH3T3中表達(dá)相對(duì)較低。在人的18株細(xì)胞系中，miR-370在兩株K562和PANC-1癌細(xì)胞系和正常膀胱細(xì)胞系（SV-HUC-1）的表達(dá)水平較高，而在其他的細(xì)胞系中表達(dá)相對(duì)較低。在小鼠睪丸間質(zhì)瘤細(xì)胞MLTC-1和

4、小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞 TM3中， miR-370是差異表達(dá)的，通過對(duì)這兩種細(xì)胞Gtl2-DMR區(qū)DNA甲基化分析及5-Aza-CdR處理TM3的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示miR-370的表達(dá)水平受 DNA甲基化調(diào)控，但其表達(dá)量與細(xì)胞的增殖能力沒有直接的聯(lián)系。通過生物信息學(xué)預(yù)測篩選了小鼠3個(gè)候選靶基因（Dnmt3a，Dnmt3b，Itgb8）和人的3個(gè)候選靶基因（STAT3，ASB15和SLC4A4），利用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和Western blot證實(shí)，D

5、nmt3a為miR-370的一個(gè)靶基因。
　　其次，為了進(jìn)一步明確miR-370的時(shí)空表達(dá)模式與胚胎發(fā)育的關(guān)系，本課題選取著床前小鼠胚胎進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 RT-PCR分析，結(jié)果顯示在囊胚期之前幾乎檢測不到miR-370成熟體的表達(dá)，而在著床時(shí)miR-370的表達(dá)發(fā)生了顯著的激活。miR-370的激活表達(dá)在E9.5達(dá)到峰值，并在胚胎中后期維持較高的表達(dá)水平，并隨著中后期發(fā)育的進(jìn)程稍顯降低。全胚胎原位雜交的結(jié)果顯示， miR-370在小鼠

6、 E9.5-E11.5胚胎的腦組織和神經(jīng)管中有集中的高表達(dá)，暗示可能參與并調(diào)控這一時(shí)期中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。而 E15.5天小鼠胚胎切片原位雜交和不同組織間的實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析顯示miR-370是一個(gè)具有組織特異性表達(dá)的基因，即miR-370在胚期的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于成體組織，且在胚期主要集中于部分腦組織、腎上腺、背根神經(jīng)節(jié)、舌、嗅覺外皮層及多數(shù)骨質(zhì)原基表達(dá)，而在肝、肺、心臟、腎臟等實(shí)質(zhì)性臟器中表達(dá)水平較低。
　　為了進(jìn)一步研究m

7、iR-370在小鼠胚胎發(fā)育中的功能，利用原核注射技術(shù)構(gòu)建了miR-370過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。通過對(duì)后代的表型分析發(fā)現(xiàn) miR-370轉(zhuǎn)基因雄鼠在出生前后體重均有10％左右的增加，而雌性小鼠和胎盤重量變化并不顯著。在轉(zhuǎn)基因鼠的繁育過程中發(fā)現(xiàn)miR-370轉(zhuǎn)基因小鼠每胎產(chǎn)子數(shù)較野生型低2.56個(gè)，異常死亡個(gè)體增多，并偶發(fā)畸胎瘤，且轉(zhuǎn)基因小鼠每胎雌鼠與雄鼠數(shù)量的比值下降至0.51。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠定量 RT-PCR檢測，miR-370在胚

8、期的表達(dá)水平基本正常，個(gè)別個(gè)體表達(dá)高于正常水平的2倍左右。而miR-370在成體轉(zhuǎn)基因鼠的表達(dá)則主要富集在舌和精巢組織，均達(dá)到4倍左右。故本研究以精巢組織作為主要的研究對(duì)象，并利用 qRT-PCR驗(yàn)證了miR-370對(duì)Dnmt3a在轉(zhuǎn)錄水平上的靶向性，同時(shí) miR-370和Dnmt3a共定位的實(shí)驗(yàn)證明 miR-370富集與其靶基因 Dnmt3a蛋白存在相似的細(xì)胞類型定位，并且表達(dá)水平上兩者存在一定程度的負(fù)相關(guān)。然而在 E18.5天與6周

9、齡成鼠兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上，未能觀測到轉(zhuǎn)基因小鼠的精巢和對(duì)照組在IG-DMR區(qū)的甲基化水平存在明顯的差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-370轉(zhuǎn)基因小鼠，其精巢組織發(fā)生了明顯的表型改變，其中心區(qū)域曲細(xì)精管排列松散，曲細(xì)精管異常萎縮，睪丸間充質(zhì)細(xì)胞數(shù)目顯著減少，伴隨精子密度偏低，精子質(zhì)量各項(xiàng)指標(biāo)出現(xiàn)顯著異常。
　　綜上所述， miR-370是一個(gè)在小鼠胚胎發(fā)育過程中時(shí)空特異性表達(dá)的miRNA，在細(xì)胞水平和體內(nèi) miR-370均可以靶向甲基轉(zhuǎn)移酶