白菜miR158的表達(dá)及其在花粉發(fā)育中的功能鑒定.pdf

1、植物microRNA（miRNA）是一種植物內(nèi)源產(chǎn)生的非編碼RNA，通過(guò)對(duì)其靶基因表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控，從而參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。花粉發(fā)育是種子植物有性生殖的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。有報(bào)道多個(gè)miRNA可能參與花粉發(fā)育過(guò)程。在前期的研究中，本實(shí)驗(yàn)室以一對(duì)隱性基因控制的白菜核不育兩用系‘Bcajh97-01A/B’為材料，對(duì)花粉發(fā)育相關(guān)miRNA進(jìn)行了高通量測(cè)序，鑒定到miR158在不育株和可育株中差異表達(dá)明顯，并發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)白菜mi158可引起花

2、粉發(fā)育異常。
　　在本文中，我們繼續(xù)對(duì)白菜mi158在花粉發(fā)育過(guò)程中的功能進(jìn)行研究。首先克隆了白菜miR158的兩個(gè)前體基因及其靶基因Bra027656，隨后利用qRT-PCR和啟動(dòng)子-GUS報(bào)告系統(tǒng)分析了白菜miR158兩個(gè)前體基因的時(shí)空表達(dá)模式，最后通過(guò)觀察過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)白菜miR158引起的轉(zhuǎn)基因植株表型差異，對(duì)白菜miR158及其靶基因的功能和可能的作用模式進(jìn)行了初步的研究。獲得的主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　(1)以

3、預(yù)測(cè)得出的白菜miR158的兩個(gè)前體發(fā)卡序列為依據(jù)設(shè)計(jì)引物，克隆獲得白菜miR158的兩個(gè)前體基因。這兩個(gè)前體基因分別位于5號(hào)和8號(hào)染色體，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能夠形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)在miRNA和miRNA*區(qū)域高度保守，這符合miRNA的進(jìn)化特征，也暗示了miR158功能的保守性。共線性分析結(jié)果表明這兩個(gè)前體基因所在的基因組區(qū)域能夠?qū)?yīng)到擬南芥miR158a所在的區(qū)域，系原始的Ath-miR158a伴隨蕓薹屬基因組三倍化后保留的產(chǎn)物，因此

4、我們將其分別命名為Bra-miR158a1和Bra-miR158a2。
　　(2)利用RACE技術(shù)分析明確了白菜miR158的靶基因Bra027656的5'和3'cDNA序列，并據(jù)此設(shè)計(jì)引物克隆獲得該基因。其DNA序列全長(zhǎng)2175 bp，由兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子組成，ORF全長(zhǎng)2046bp，編碼一個(gè)由682個(gè)氨基酸組成的PPR(pentatricopeptide repeat)蛋白。通過(guò)BLAST搜索，發(fā)現(xiàn)Bra027656氨基酸

5、序列與蘿卜的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系育性恢復(fù)相關(guān)PPR-B蛋白氨基酸序列高度相似。這暗示了Bra027656可能與PPR-B具有相同的作用模式。
　　(3) qRT-PCR分析結(jié)果表明pre-Bra-miR158a1和pre-Bra-miR158a2的表達(dá)存在時(shí)空差異。雖然兩者均在花序中有較高的表達(dá)量，但前者的相對(duì)表達(dá)量高于后者，尤其是在第三級(jí)花蕾時(shí)期（單核花粉粒時(shí)期），啟動(dòng)子-GUS報(bào)告系統(tǒng)分析Bra-miR158a1和Bra-miR1

6、58a2的啟動(dòng)子活性也獲得了相似的結(jié)果。據(jù)此，我們認(rèn)為白菜miR158可能在花粉發(fā)育的單核花粉粒至雙核花粉粒時(shí)期發(fā)揮作用，而且pre-Bra-miR158a1對(duì)miR158的合成起主效作用。通過(guò)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)pre-Bra-miR158a1和pre-Bra-miR158a2啟動(dòng)子序列存在較大的差異，推測(cè)兩者差異的時(shí)空表達(dá)模式可能是由啟動(dòng)子序列的差異引起。
　　(4)構(gòu)建抑制表達(dá)Bra-miR158載體，連同前期已構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)Br

7、a-miR158載體轉(zhuǎn)化‘油青四九’菜心。通過(guò)對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行細(xì)胞學(xué)和形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Bra-miR158轉(zhuǎn)基因植株藥室中約25％的花粉喪失活力，無(wú)活力花粉的異常發(fā)育始于單核小孢子時(shí)期，花粉內(nèi)含物降解，花粉皺縮或空泡化。結(jié)合Bra-miR158的時(shí)空表達(dá)模式，這說(shuō)明白菜miR158對(duì)花粉的形成具有重要作用。然而，抑制表達(dá)Bra-miR158轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)發(fā)育并未出現(xiàn)異常，這說(shuō)明存在白菜miR158靶因的下游基因?qū)Π谢虻娜笔?/p>