瓊膠糖降解菌的鑒定和選育及其發(fā)酵產(chǎn)物的研究.pdf

1、瓊膠被公認(rèn)為是一種安全的食品添加劑。瓊膠來源的寡糖包括瓊膠寡糖(agaro-oligosaccharides，AOS)和新瓊寡糖（neoagaro-oligosaccharides，NAOS），是一類新型的海洋功能性低聚糖。瓊膠寡糖的生物活性正在逐漸被挖掘，不僅具有功能性低聚糖的一般特性，還具有許多普通寡糖無法替代的生理功能特性，如抑菌作用、增殖腸道益生菌作用、抗氧化作用、抗病毒作用、抗炎作用、抗齲齒及抗淀粉老化等多方面生物活性，對黑素

2、瘤細胞有增濕美白作用。因此，瓊膠低聚糖在食品、化妝、醫(yī)藥等行業(yè)具有很大的潛在應(yīng)用價值。迄今為止，實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的只有從大西洋假單孢菌（Pseudomonas atlantica）中分離的β-瓊膠酶，并且價格昂貴，應(yīng)用范圍也僅限于科研工作，大大阻礙了瓊膠酶及瓊膠低聚糖的開發(fā)應(yīng)用，因而對瓊膠酶的研究具有極其重要的意義。
　　 本論文主要對高活性的瓊脂糖降解菌的篩選鑒定、瓊脂糖降解菌的誘變育種、瓊脂糖降解菌發(fā)酵條件的優(yōu)化、假別單胞菌

3、fmb-A18細胞制備瓊膠寡糖進行了研究，旨在為瓊膠低聚糖的生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果分述如下:
　　 1.從海水中分離篩選得到了瓊脂糖降解菌并對其進行鑒定。采用人工海水培養(yǎng)基初篩、搖瓶復(fù)篩的篩選策略，從連云港近海海水中分離篩選到一株具有瓊膠酶活性的菌株fmb-A17，其瓊膠酶活為4.5 U/mL。通過對其形態(tài)特征、生理生化特征進行鑒定，初步判定該菌株為假別單胞菌Pseudoalteromonas。采用細菌16S rDNA

4、序列的通用引物對菌株fmb-A17進行PCR擴增，獲得1147 bp的片段。將該PCR產(chǎn)物在GenBank數(shù)據(jù)庫中BLAST軟件進行同源搜索比對，利用Clustal X1.83和MEGA4.0軟件進行多重比較后繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明:菌株fmb-A17的16S rDNA序列與假別單胞菌Pseudoalteromonas sp.BSs20060的16S rDNA序列同源性達99％;在系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株fmb-A17與P.tunitaca

5、在同一分支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合常規(guī)形態(tài)特征、生理生化特征，鑒定該菌株為假別單胞菌Pseudoalteromonas。
　　 2.瓊脂糖降解菌fmb-A17的誘變育種。采用了NTG、EMS、LiCl和低能氮離子束注入等四種誘變方法同時對Pseudoaltermonas sp.fmb-A17進行誘變，確定了最佳的誘變條件。結(jié)果表明，NTG誘變的最佳濃度是10μg/mL，EMS的最佳濃度是0.07mol/mL，LiCl的最佳濃度是1％

6、，在10 kev能量下，選擇氮離子注入時間為10s。最終，獲得突變株fmb-A18酶活為7.38 U/mL，且遺傳性狀穩(wěn)定。
　　 3.瓊脂糖降解菌突變株fmb-A18的發(fā)酵條件優(yōu)化。先后通過單因素實驗、 Plackett-Burma設(shè)計以及響應(yīng)曲面設(shè)計，確定菌株fmb-A18發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳條件。結(jié)果表明:單因素實驗的最佳條件為，培養(yǎng)溫度28℃、轉(zhuǎn)速180 rpm、裝液量50 mL、接種量10％、發(fā)酵時間24 h，瓊脂粉0.2％

7、、酵母粉0.1％、麥芽糖0.1％、檸檬酸三銨0.1％、MgSO4·7H2O0.5％、KCl1 mmol/L、K2HPO4100μmol/L、CaCl2100μmol/L、FeSO4.7H21μmol/L; PB設(shè)計篩選得到的發(fā)酵培養(yǎng)基的關(guān)鍵因子為酵母粉、麥芽糖和KCl，并確定響應(yīng)曲面的中心點為:酵母粉0.24％、麥芽糖0.2％、KCl1 mmol/L;響應(yīng)曲面法設(shè)計確定了最終培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為麥芽糖1.706 g/L、酵母粉1.174

8、g/L、KCl1.021 mmol/L、NaCl40 g/L、FeSO40.5μmol/L、K2HPO4100μmol/L、檸檬酸三銨1 g/L、MgSO45g/L、瓊脂粉2.4 g/L，在此發(fā)酵條件下，菌株fmb-A18發(fā)酵上清的酶活可達到15.044 U/mL，比原始培養(yǎng)條件提高了103.85％。
　　 4.假別單胞菌fmb-A18細胞制備瓊膠寡糖。通過對瓊脂糖、酵母粉、檸檬酸三銨、MgSO4、NaCl、發(fā)酵時間等因素對Ps

9、eudoalteromonas sp.fmb-A18細胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)瓊膠寡糖的影響進行了考察和分析，其發(fā)酵上清液經(jīng)離心除菌，75％乙醇沉淀，通過大孔樹脂NAK-Ⅱ靜態(tài)及動態(tài)吸附、DEAE-Sephcel陰離子交換層析、HiTrapTMDesalting脫鹽層析和Sephadex G15葡聚糖凝膠層析，獲得HPLC為單一峰的瓊膠寡糖，并對其進行了鑒定。結(jié)果表明:由單因素實驗獲得的Pseudoalteromonas sp.fmb-A18細胞轉(zhuǎn)

10、化法生產(chǎn)瓊膠寡糖的反應(yīng)最佳體系為，瓊脂糖濃度為0.4％、酵母粉濃度為20 g/L、檸檬酸三銨濃度為8 g/L、MgSO4的濃度為2g/L、NaCl的濃度為6g/L，發(fā)酵60 h，在此條件下測得發(fā)酵上清液的總糖含量為5 mg/mL;大孔樹脂靜態(tài)吸附實驗中，七種大孔樹脂中NAK-Ⅱ?qū)Ν偰z寡糖的處理效果最佳，在最佳的靜態(tài)吸附條件下(pH值10.0、溫度40℃、吸附時間18h)，NAK-Ⅱ樹脂對粗寡糖溶液的蛋白清除率和寡糖殘留率分別為70-85

11、％和75-80％;大孔樹脂NAK-Ⅱ動態(tài)吸附實驗的結(jié)果表明，在最佳的動態(tài)吸附實驗條件下（流速1 mL/min、5 mg/mL的粗寡糖溶液），NAK-Ⅱ樹脂對粗寡糖溶液的蛋白清除率和寡糖殘留率最高達到80％，最低為65％;大孔樹脂處理后的粗寡糖樣品經(jīng)DEAE-Sephcel陰離子交換、 HiTrapTMDesalting脫鹽和Sephadex G15葡聚糖柱層析后得到純度為91.36％的寡糖組分GA-1，經(jīng)高效液相色譜分析得GA-1是一個