天然免疫細胞參與HBV耐受以及HBV誘導肝癌的機制研究.pdf

1、肝臟作為重要的代謝器官，廣泛參與糖代謝，蛋白質代謝以及脂類代謝。肝臟同時也是一個重要的免疫器官，富含大量天然樣免疫細胞以及獲得樣免疫細胞，其在自免疫性炎癥，微生物感染以及腫瘤的免疫監(jiān)視過程中發(fā)揮著重要的作用。由于肝臟具備天然免疫優(yōu)勢狀態(tài)，同時富含大量的調節(jié)性細胞以及獨特的結構特征，容易在肝臟引發(fā)全身耐受，因而肝臟又是一個重要的耐受器官。
　　嗜肝病毒感染，如乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染肝臟后，容易

2、誘發(fā)肝臟耐受，形成慢性HBV感染(Chronic Hepatitis B，CHB)。病毒特異性T細胞免疫應答以及體液免疫應答對于病毒的清除至關重要，但是在CHB患者肝臟以及外周血中，病毒特異性T細胞經常發(fā)生耗竭甚至克隆丟失，從而失去抗病毒能力，使得病毒抗原在肝臟中持續(xù)性表達。天然免疫系統(tǒng)對調節(jié)獲得性免疫應答具有重要的調節(jié)能力，在病毒感染過程中，天然免疫應答的強弱以及持續(xù)時間對于病毒特異性T細胞免疫應答或者抗體產生息息相關，比如樹突狀細胞

3、(dendritic cell，DC)，macrophage等呈遞抗原的能力，又比如NK細胞，Th1細胞產生IL-2促進CD8+T細胞存活和擴增等。在本文中我們著重研究了γδT細胞—一類重要的天然樣免疫細胞—在HBV耐受過程中的作用，我們的結果表明其似乎更像是發(fā)揮著旁觀者效用。
　　慢性HBV感染與肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)的發(fā)生密切相關。我國目前每年約有30萬人死于肝臟腫瘤，其中絕大部分

4、為慢性HBV攜帶者。HBV感染肝細胞后，基因組發(fā)生的隨機插入以及HBx蛋白的表達與肝細胞惡性化密切相關。同時HBV病理學進程表明，當肝臟中HBV病毒復制活躍，這時期可觀察到顯著的肝臟炎癥，這類HBV攜帶者更容易發(fā)生肝細胞癌變，暗示肝臟慢性炎癥對于HCC的發(fā)生密切相關，這也與目前廣泛接受的慢炎誘癌學說不謀而合。因而研究HBV誘導的肝細胞癌為臨床治療提供了新的理論依據。本文將闡釋在原發(fā)性肝臟腫瘤發(fā)生過程慢性炎癥發(fā)揮著重要的作用。
　　

5、本文取得的主要結果從以下兩個方面概述。
　?、?、γδT細胞調節(jié)肝臟免疫耐受的研究本研究采取pAAV/HBV1.2以及rAAV/HBV1.3病毒注射構建了HBV攜帶小鼠，WTHBV攜帶小鼠可檢測到肝實質中病毒抗原的表達，并且分泌到胞外在血清中可以檢測到高濃度的HBsAg，HBeAg，HBV-DNA等表達，同時肝臟幾乎沒有炎癥，抗原特異性體液免疫應答以及T細胞免疫應答均受損;因而該模型模擬了人群中的慢性HBV攜帶者免疫耐受期的狀態(tài)。<

6、br>　　首先我們檢測到HBV耐受小鼠中γδT細胞的總數尤其是Vγ4細胞亞群發(fā)生了顯著的上調。進一步我們采取TCRδ-/-小鼠觀察到HBV耐受不能形成，血清中HBV抗原以及肝臟表達的HBc抗原明顯下降直至消失。采用Anti-γδTCR清除HBV攜帶小鼠全身γδT細胞也獲得了類似的結果;進一步我們分選出γδT細胞轉輸TCRδ-/-小鼠后，HBV耐受恢復，因此表明，γδT細胞對于HBV耐受的形成至關重要。
　　接下來我們檢測發(fā)現TCR

7、δ-/-小鼠相比WT小鼠，肝臟HBV特異性體液免疫應答沒有差異，調節(jié)性T細胞和Kupffer細胞比例也沒有差異;非常有意思的是肝臟的HBV特異性CD8+T細胞比例以及功能均發(fā)生了顯著的上升;表征CD8+T細胞的耗竭被逆轉。
　　進一步我們發(fā)現γδT細胞對于CD8+T細胞的耗竭發(fā)揮著旁觀者效應。持續(xù)性表達的HBV抗原對于γδT細胞產生IL-17進而招募髓系來源抑制細胞(MDSC)進入肝臟至關重要。MDSC繼而通過產生iNOS以及ar

8、ginase-1直接抑制了CD8+T細胞的活化。在IL-17-/-小鼠中，我們也觀察到MDSC顯著減少，同時CD8+T細胞功能恢復，并且HBV耐受不能形成。體內抑制arginase-1亦顯著改善CD8+T細胞功能并且加速HBV排斥。
　　綜上所述;γδT細胞作為一種天然樣T細胞，在HBV耐受的形成過程中起始了MDSC的肝臟聚集，誘使CD8+T細胞發(fā)生功能耗竭而導致肝臟耐受。靶向這一過程能顯著改善HBV特異性T細胞功能，促進HBV的

9、排斥。
　?、?、NK細胞抵抗CCl4誘導的肝細胞癌的研究本研究采取HBV轉基因小鼠模型，由于該小鼠具備輕微自發(fā)炎癥且自然發(fā)生肝臟腫瘤，很好的模擬了臨床上HBV患者高發(fā)肝細胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)的現象。為了驗證慢性炎癥誘發(fā)腫瘤，我們采取連續(xù)CCl4注射誘導肝臟持續(xù)性炎癥，觀察到在HBV轉基因小鼠中約6個月即發(fā)生肝臟腫瘤，表明慢性炎癥確實促進了肝臟腫瘤的發(fā)生。
　　進一步我們發(fā)現CCl4誘

10、導HBV轉基因小鼠肝臟炎癥的同時，伴隨著肝臟上皮間質轉化(EMT)的發(fā)生，EMT被認為是腫瘤生長以及遷移的重要機制。同時我們注意到肝臟NK細胞活化性分子下調，抑制性分子上調，表明NK細胞受到抑制。進一步我們觀察到清除NK細胞后，肝臟EMT標志蛋白vimentin表達顯著上調。清除NK細胞后可觀察到慢性炎癥誘導的肝臟腫瘤顯著增多;表明NK在該過程中發(fā)揮著免疫監(jiān)視功能。采取PloyⅠ∶C活化NK細胞，可顯著減少CCl4誘導的肝臟腫瘤的發(fā)生。

11、
　　此外，我們慢炎誘癌的模型還可以用于肝臟腫瘤的治療和預防研究。比如由于免疫細胞可能介導了肝臟炎癥，因而采取了免疫抑制劑處理，觀察到抑制免疫細胞后，肝臟腫瘤生長更快;而采取非甾體類抗炎藥處理，我們觀察到一定的抑癌效果。非常有意思的是，PolyⅠ∶C處理HBV轉基因小鼠后可以顯著預防肝臟腫瘤的發(fā)生。
　　綜上所述，我們構建了一個非常實用的慢性炎癥誘導肝臟腫瘤模型，并且觀察到NK細胞通過靶向抑制EMT發(fā)揮免疫監(jiān)視功能。采用非甾