小干擾RNA沉默ARNT基因?qū)θ私Y(jié)腸癌HT29細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、背景：結(jié)直腸癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，在發(fā)達(dá)國家發(fā)病率居惡性腫瘤第2位。我國結(jié)直腸癌發(fā)病率為20.6/10萬，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。手術(shù)切除是結(jié)腸癌主要的治療手段，但有40％-50％的患者會出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，其中大多數(shù)患者失去再治愈的機(jī)會。因此，尋找新的有效治療手段成為腫瘤學(xué)家共同關(guān)注的焦點(diǎn)。缺氧是實(shí)體腫瘤進(jìn)程中的普遍現(xiàn)象，結(jié)腸癌是局部微環(huán)境缺氧比較顯著的實(shí)體腫瘤之一。因此，了解結(jié)腸癌的微環(huán)境缺氧分子機(jī)制也許可以為結(jié)腸癌

2、的治療提供新的策略?；铙w內(nèi)芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)子(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT)是許多堿性螺旋-環(huán)-螺旋-PAS(basic helix-loop-helix Per-Arnt-Sim，bHLH-PAS)蛋白共同的專性二聚化配偶體，其中包括芳香烴受體(AhR)、低氧誘導(dǎo)因子(HIF)1α、2α和3α、SIM蛋白等，其參與機(jī)體內(nèi)許多與缺氧有關(guān)的重要的生物學(xué)過程。研究表明

3、AhR可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展，HIF-1α在提高結(jié)腸癌細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境、促進(jìn)腫瘤血管生成與侵襲中扮演重要角色，Xue X等研究顯示激活HIF-2α能促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)展，但I(xiàn)mamura T等的報道提示在S-W480結(jié)腸癌細(xì)胞中HIF-2α抑制其生長，HIF-3α可能是缺氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子、與細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此，沉默ARNT基因后，使AhR、HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α缺乏對應(yīng)的亞基，繼而對結(jié)腸癌細(xì)胞的

4、生物學(xué)特性會產(chǎn)生怎樣的影響目前尚不清楚。人的ARNT基因位于1號染色體(1q21)，其cDNA全長為2604 bp，開放閱讀框2367 bp，為真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子bHLH-PSA蛋白家族成員，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。Chang KY等研究提示ARNT可能與人類宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。相關(guān)研究表明ARNT與肝癌的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)。ARNT基因與人類結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是正相關(guān)還是負(fù)相關(guān)目前尚不清楚。也有研究表明ARNT能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷

5、移和血管分支生成，而血管增生可以促進(jìn)結(jié)腸癌的生長。但目前ARNT基因在人類結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中的地位尚不明確。慢病毒載體(lentiviral vector，LV)可以攜帶短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）表達(dá)組件進(jìn)入宿主基因組，通過RNA Pol-Ⅲ啟動子表達(dá)shRNA，其莖環(huán)結(jié)構(gòu)的中間序列則被Dicer酶識別并切除，產(chǎn)生的小干擾RNA(siRNA)可觸發(fā)內(nèi)源性mRNA的降解。慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾已被證明最

6、有效和最穩(wěn)定，這基于其具有轉(zhuǎn)移基因片段容量大、轉(zhuǎn)基因效率高、不易引發(fā)宿主免疫反應(yīng)、轉(zhuǎn)基因可以持續(xù)而高效表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)檢索，目前尚無將RNAi技術(shù)應(yīng)用于結(jié)腸癌HT29細(xì)胞ARNT基因的研究報道。
　　 目的：獲取有效沉默人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞ARNT基因的shRNA重組慢病毒;探討慢病毒介導(dǎo)的siRNA沉默ARNT基因后對人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞體外增殖、凋亡和體內(nèi)成瘤的影響。為結(jié)腸癌的治療提供新的策略。
　　 方法：⑴針對目的

7、基因序列(Gene ID:405)，利用公用網(wǎng)站中提供的RNA干擾序列設(shè)計原則，設(shè)計多個RNA干擾靶點(diǎn)序列，根據(jù)設(shè)計軟件進(jìn)行評估測定，選擇4組最佳的動力學(xué)參數(shù)靶點(diǎn)。使用RNA干擾實(shí)驗中公認(rèn)序列(Negative Control，NC)Scramble序(5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3')作為陰性對照，此序列不與任何人類基因序列同源。構(gòu)建4組表達(dá)ARNT-shRNA的慢病毒載體和1組無效干擾慢病毒載體并測序鑒定。⑵提取3

8、種質(zhì)粒(GV115、pHelper1.0和pHelper2.0)，以紫外光吸收法測定其濃度及純度。按Lipofectamine2000說明書轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。收集轉(zhuǎn)染后48h的293T細(xì)胞上清液，離心濃縮后-80℃保存。多孔稀釋熒光法測定病毒滴度。⑶實(shí)驗前1天，用HT29細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板中的12個孔，細(xì)胞濃度為5×104/ml，體積100μl/孔。細(xì)胞分為4組，每組設(shè)3個不同梯度的感染復(fù)數(shù)(Multiplicity ofInfect

9、ion，MOI)。實(shí)驗開始時，配備1×108、1×107、1×106TU/ml病毒液。取2μl10mg/ml聚凝胺(polybrene)稀釋到400μl，備用。棄去所有孔內(nèi)原有培養(yǎng)基，1-6孔內(nèi)每孔加入完全培養(yǎng)基80μl，7-12孔內(nèi)每孔加入ENi.S.80μl。將3種不同梯度的病毒液加入到各組的相應(yīng)孔中，10μl/孔。1-3孔內(nèi)每孔加入10μl完全培養(yǎng)基，4-6和10-12孔內(nèi)每孔加入10μl polybrene稀釋液，7-9孔內(nèi)每孔

10、加入10μl ENi.S.，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)。每天熒光顯微鏡下觀察拍照1次，了解熒光表達(dá)情況，確定最佳感染參數(shù)和轉(zhuǎn)染慢病毒后熒光蛋白表達(dá)最強(qiáng)時間。后續(xù)實(shí)驗均采用最佳參數(shù)轉(zhuǎn)染。⑷分別以MOI=0、10、15、25、50、100、150的重組慢病毒轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞，72h后利用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。后續(xù)實(shí)驗均采用最佳MOI。⑸細(xì)胞分為空白對照、LV-ARNT-RNAi-nc、LV-ARNT-RNAi-1、LV-ARNT-RNAi-2、LV-

11、ARNT-RNAi-3和LV-ARNT-RNAi-4六組。轉(zhuǎn)染前1天將HT29細(xì)胞接種至6孔板中，1×105/孔，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合達(dá)到30％～50％之間。轉(zhuǎn)染時，去除孔內(nèi)的培養(yǎng)基，將含病毒的完全培養(yǎng)基加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，MOI=100，同時加入工作液濃度為5μg/μl的polybrene，8h后棄除含病毒的培養(yǎng)基，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。將成功轉(zhuǎn)染慢病毒的細(xì)胞通過有限稀釋法種于96孔培養(yǎng)板，待形成境

12、界清楚的克隆，挑取表達(dá)熒光蛋白的單克隆接種至24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)。通過克隆稀釋擴(kuò)大培養(yǎng)獲取5組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。⑹提取RNA或蛋白前，每個樣本隨機(jī)選擇3個觀察點(diǎn)拍照（放大200倍），通過陰陽對比圖，粗略計數(shù)帶熒光細(xì)胞占總細(xì)胞比例。⑺配置1％瓊脂糖凝膠制板，將與溴酚藍(lán)混合后的電泳樣品依次點(diǎn)入加樣孔中，進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后取出凝膠，放入溴化乙錠(EB)溶液中染色，清水漂洗后放于紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果，并拍照記錄。⑻按加入cDNA模板起始量分

13、為0.1、0.5、1、2μl共4組，每組6個復(fù)孔，其中一半復(fù)孔加ARNT引物，另一半加3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)引物，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，重復(fù)3次。計算出ARNT和GAPDH的ΔCT值，通過cDNA濃度梯度的log值對ΔCT值作圖，得直線相關(guān)系數(shù)r。根據(jù)《醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)》第二版（孫振球等主編）第9章第2節(jié)相關(guān)系數(shù)統(tǒng)計推斷，如果所得α＞0.05，說明目的基因與內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率相同，可以用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量。⑼PCR

14、檢測HT29細(xì)胞ARNTmRNA的表達(dá)水平:提取細(xì)胞總RNA后，檢測其吸光度(OD260/OD280)值和濃度，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按SYBR(@) Premix Ex TaqTM試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每組設(shè)立3個復(fù)孔，反應(yīng)程序:預(yù)變性，95℃30S;PCR反應(yīng)，95℃5S、60℃34S，40個循環(huán)。溶解曲線確定產(chǎn)物特異性。以GAPDH為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。Western blot檢測ARNT蛋白的表達(dá)水平:收

15、集細(xì)胞，抽提蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。封閉后，加入ARNT抗體和兔抗β-肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體，置于4℃雜交過夜。次日，加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫反應(yīng)1h。檢測雜交信號。測量顯影片的灰度值。以β-actin基因作為內(nèi)參進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，以空白對照組做為參照樣本，計算其余各組蛋白的相對水平。實(shí)驗重復(fù)3次，篩選出有效沉默靶點(diǎn)。

16、⑽用未轉(zhuǎn)染慢病毒HT29細(xì)胞株、LV-ARNT-RNAi-nc和LV-ARNT-RNAi-3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株接種于96孔板，每組6孔。CCK-8法檢測常氧環(huán)境下細(xì)胞體外增殖。⑾實(shí)驗分為空白對照、LV-ARNT-RNAi-nc和LV-ARNT-RNAi-3三組，將各組細(xì)胞種于6孔板內(nèi)。用Annexin-V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑染色凋亡細(xì)胞，用BD FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。⑿用裸鼠成瘤實(shí)驗檢測ARNT-

17、shRNA沉默HT29細(xì)胞ARNT基因表達(dá)后對腫瘤體內(nèi)生長的影響。裸鼠隨機(jī)分為A、B兩組（每組6只），組內(nèi)再隨機(jī)分兩組（每組3只）:A1-A3裸鼠左側(cè)背部接種arnt-RNAi-3細(xì)胞，右側(cè)背部接種arnt-RNAi-nc細(xì)胞;A4-A6裸鼠左側(cè)背部接種arnt-RNAi-nc細(xì)胞，右側(cè)背部接種arnt-shRNA-3細(xì)胞。B1-B3裸鼠左側(cè)背部接種空白對照組細(xì)胞，右側(cè)背部接種arnt-RNAi-nc細(xì)胞;B4-B6裸鼠左側(cè)背部接種ar

18、nt-RNAi-nc細(xì)胞，右側(cè)背部接種空白對照組細(xì)胞。在無菌條件下裸鼠背側(cè)肩胛部皮下接種，細(xì)胞濃度為2×106/ml，按100μl/部位接種。飼養(yǎng)4周后頸椎脫位法處死裸鼠，剝離瘤體后由專人盲法稱重(G)和測體積(V)。
　　 結(jié)果：⑴測序結(jié)果表明合成的ARNT-shRNA核苷酸序列插入正確，無堿基缺失和替換。對測序結(jié)果正確的克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，測重組慢病毒質(zhì)粒DNA，A260/A280值為1.8～1.9，說明質(zhì)粒DNA的純度和完整

19、性很高。⑵提取的病毒液體積和滴度分別為120μl，1.0E+9TU/ml(LV-ARNT-RNAi-1);200μl,6.0E+8TU/ml(LV-ARNT-RNAi-2);200μl,6.0E+8TU/ml(LV-ARNT-RNAi-3);160μl,8.0E+8TU/ml(LV-ARNT-RNAi-4);120μl,1.0E+9 TU/ml(LV-ARNT-RNAi-nc)。說明有大量質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，病毒包裝成功。⑶加入感染添

20、加劑polybrene輕度增加慢病毒轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率;使用感染增強(qiáng)液ENi.S.未見明顯提高病毒對HT29細(xì)胞的感染能力;轉(zhuǎn)染慢病毒后第2天可見部分細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白，第3天和第4天細(xì)胞視野內(nèi)發(fā)現(xiàn)表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)量和熒光強(qiáng)度無明顯差異，考慮細(xì)胞生長周期，確定轉(zhuǎn)染慢病毒后72h為觀察慢病毒轉(zhuǎn)染效率最佳時間。⑷MOI=0、10、15、25、50、100、150時，轉(zhuǎn)染效率依次為0、25.82、35.90、53.50、64.59、7

21、5.90、78.50％。隨著MOI的遞增，轉(zhuǎn)染效率增加明顯緩慢，考慮慢病毒用量，確定MOI=100為最佳轉(zhuǎn)染條件。⑸可以觀察到發(fā)綠色熒光的細(xì)胞比例大于90％，認(rèn)為感染效率達(dá)到要求，可以收集細(xì)胞提取總RNA和總蛋白進(jìn)入后續(xù)篩選實(shí)驗。⑹電泳結(jié)果顯示產(chǎn)物分子大小和理論值一致，未見非特異性條帶，說明引物有效。⑺r=0.0451，根據(jù)檢驗統(tǒng)計量t值公式，所得t值為0.0638，v=2，查t界值表，得α大于0.05，接受H0，說明目的基因和內(nèi)標(biāo)基因

22、擴(kuò)增效率相同，可用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量。⑻成功構(gòu)建4組表達(dá)ARNT-shRNA的重組慢病毒，其中1組（LV-ARNT-RNAi-3）轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞后能有效沉默ARNT基因，mRNA相對表達(dá)下降70％（P＜0.05），蛋白水平表達(dá)下降60％(P＜0.05)。⑼LV-ARNT-RNAi-3組細(xì)胞增殖明顯高于LV-ARNT-RNAi-nc和空白對照組(P＜0.05)，LV-ARNT-RNAi-nc組和空白對照組之間細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計學(xué)

23、意義(P＞0.05)。單因素重復(fù)測量方差分析（Test of Between-Subjects Effects）:不同樣本組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=116.235，P=0.000），不同時間之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=607.075，P=0.000)。單因素方差分析(ANOVA):4 hours，F(xiàn)=0.441、P=0.651;1 day, F=37.500、P=0.000;2days,F=56.244、P=0.000;3 days,

24、F=32.701、P=0.000。⑽常氧環(huán)境下，LV-ARNT-RNAi-3組凋亡率明顯高于空白對照組（P=0.000），低于LV-ARNT-RNAi-nc組(P=0.003)。⑾皮下注射腫瘤懸浮液后第3天A組裸鼠死亡1只。5天后，所有裸鼠注射部位可觸及腫塊。A組裸鼠，LV-ARNT-RNAi-3轉(zhuǎn)染組腫瘤體積和質(zhì)量均明顯大于LV-ARNT-RNA-nc轉(zhuǎn)染組（t=2.872、P=0.038，t=3.069、P=0.033）;B組裸鼠，

25、未轉(zhuǎn)染組腫瘤體積和質(zhì)量與LV-ARNT-RNAi-nc轉(zhuǎn)染組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.998、P=0.342，t=0.503、P=0.626）;A、B兩組裸鼠之間:左右側(cè)腫瘤體積之和相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.564、P=0.587），左右側(cè)腫瘤質(zhì)量之和相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.090、P=0.930），種瘤時裸鼠質(zhì)量相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.000、P=1.000），猝死時裸鼠質(zhì)量相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.6