促紅細(xì)胞生成素對(duì)視網(wǎng)膜光損傷的防護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、目的： 觀察玻璃體腔單次注射重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠視網(wǎng)膜光損傷誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜變性的防護(hù)作用及其機(jī)制。 方法： 1.建立大鼠視網(wǎng)膜光損傷模型并確立局部玻璃體腔注射重組人促紅細(xì)胞生成素的量效關(guān)系。選用雄性SD大鼠，體重190～210克，隨機(jī)分為正常組，對(duì)照組，以及給藥組。動(dòng)物模型采用自制光損傷箱，白色熒光燈，光照強(qiáng)度平均為2800±150Lux，光照前24小時(shí)，進(jìn)行局部玻璃體腔注射3μl不同濃度單位rhEPO，對(duì)照

2、組給予等體積的PBS。注射完畢后大鼠絕對(duì)暗適應(yīng)24小時(shí)，光照前30分鐘在暗紅燈下(光照強(qiáng)度5Lux)采用阿托品、美多麗散瞳，放入光照箱后連續(xù)光照5小時(shí)，光照結(jié)束后置于暗環(huán)境飼養(yǎng)(光照強(qiáng)度＜150Lux)，大鼠飼養(yǎng)至光照后5天進(jìn)行全視野ERG檢測(cè)后處死； 2.按照上述方法，在光照后3天取眼球進(jìn)行電鏡觀察，在第5天，10天取大鼠眼球，做石蠟切片，進(jìn)行HE染色，觀察形態(tài)改變； 3.照上述方法，在光照前給藥組玻璃體腔給予不同劑量

3、rhEPO可溶性受體，阻斷內(nèi)源性EPO，觀察其變化；另外單純光照組在光照結(jié)束后即刻給予玻璃體腔注射最佳劑量的rhEPO，在光照后3天觀察ERG變化及形態(tài)改變； 4.照前述方法，在光照后3天各組取眼球固定，做石蠟切片，進(jìn)行凋亡原位檢測(cè)(TUNEL)，同時(shí)留取視網(wǎng)膜組織進(jìn)行凋亡相關(guān)蛋白Bcl-xl，Caspase-3的檢測(cè)； 5.在光損傷后0，6，12，24，48，72小時(shí)，7d，14天取單純光照組視網(wǎng)膜組織，檢測(cè)EPO/E

4、POR蛋白以及其mRNA表達(dá)的變化，并做免疫組化，進(jìn)行定位觀察； 6.在光照后0，6小時(shí)取各組大鼠視網(wǎng)膜組織，進(jìn)行相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Akt，ERK1，2，STAT5表達(dá)的檢測(cè)，探討其可能的機(jī)制。 結(jié)果： 1.采用自制的光損傷箱，成功建立大鼠視網(wǎng)膜光損傷模型，同時(shí)通過(guò)對(duì)光照后ERG的檢測(cè)及形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)玻璃體腔注射5u/3μlrhEPO的濃度，其b波振幅較高。 2.在對(duì)光損傷后5天，10天HE染色形態(tài)觀察，r

5、hEPO給藥組外核層保存較完整，電鏡下觀察色素上皮細(xì)胞及光感受器外段、內(nèi)段保存完整，排列規(guī)則，外核層凋亡細(xì)胞較少，而對(duì)照組色素上皮細(xì)胞形態(tài)不完整，細(xì)胞器外流，感受器內(nèi)外段排列紊亂，斷裂，甚至消失，外核層有較多細(xì)胞核固縮，間隙增寬；單純r(jià)hEPO給藥組電鏡下未見(jiàn)明顯異常，ERG-b波無(wú)明顯改變。 3.光照后即刻給予rhEPO的其b波振幅較對(duì)照組高，與光照前給藥組振幅比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。 4.光照前給予EPO可溶性受體20n

6、g，可以使大鼠視網(wǎng)膜光損傷后ERG-b波較對(duì)照組低，且形態(tài)上外核層厚度減低更多。 5.TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組外核層有較多陽(yáng)性染色細(xì)胞核，而給rhEPO組有較少的陽(yáng)性著染細(xì)胞核，EPO給藥組Bcl-xl表達(dá)增高，Caspase-3表達(dá)降低。 6.光照后48小時(shí)，EPO/EPOR蛋白表達(dá)達(dá)到高峰，此后下降，EPOR表達(dá)相對(duì)維持較高水平；EPO/EPORmRNA表達(dá)增高，此后下降，但仍維持相對(duì)高的水平。EPOR的表達(dá)主要定位

7、于光感受器內(nèi)外段，外核層，內(nèi)核層，節(jié)細(xì)胞層。 7.與對(duì)照相比，光照后0，6小時(shí)，EPO給藥組信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Akt，p-Akt，STAT5，p-STAT5的表達(dá)無(wú)明顯變化，而p-ERK1，2表達(dá)較對(duì)照組減少。 結(jié)論： 1.光照前24h大鼠局部玻璃體腔給予rhEPO5U，3μl，可使大鼠視網(wǎng)膜光損傷在形態(tài)功能上得到較好的保護(hù)作用，劑量效應(yīng)曲線呈現(xiàn)鐘形；光照前給予EPO可溶性受體可使光損傷程度加重；光照5小時(shí)后給予rhE