促紅細胞生成素對視網膜神經元缺氧損傷保護作用的體外研究.pdf

1、目的：研究如何使視網膜神經細胞避免損傷或死亡即神經保護，是眼科學基礎和臨床研究的重要領域。近年來發(fā)現促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)對中樞神經系統(tǒng)的損傷后的生存、修復及預后有明顯保護作用。本實驗建立新生大鼠視網膜神經元細胞原代混合培養(yǎng)體系和Müller細胞傳代培養(yǎng)體系，分析EPI及EPO受體在正常視網膜神經元細胞以及低氧誘導時的表達，觀察缺氧損傷對培養(yǎng)的視網膜神經元的影響，并探索EPO對神經元損傷的保護作用及機制，

2、為EPO在視網膜疾病中的應用奠定理論基礎。 方法：將Wistar乳鼠視網膜通過胰蛋白酶+依地酸(EDTA)消化，制成視網膜單細胞懸液，建立一種穩(wěn)定、可靠的視網膜神經元體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)的方法，并用免疫細胞化學技術對視網膜神經元進行鑒定。低濃度氯化鈷預處理對視網膜神經元進行低氧預適應，之后制作細胞急性缺氧模型。MTT檢測評價視網膜神經元急性缺氧損傷和低氧預適應后細胞的活力改變。采用反轉錄-PCR(RT-PCR法)、免疫細胞化學方法檢

3、測EPO及EPO受體在正常視網膜神經元細胞以及低氧誘導時的表達；從細胞形態(tài)學、LDH釋放量等形態(tài)學和生化指標，觀察不同濃度rhEPO預處理對視網膜缺氧損傷的保護作用。TUNEL染色檢測視網膜神經元的凋亡，并進行形態(tài)學觀察和對照。此外，采用機械震蕩、吹打法培養(yǎng)和傳代視網膜Muller細胞，3～4代的細胞進行神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)染色，對缺氧條件下視網膜M(ü)ller細胞EPOmRNA和蛋白的表達變化進行了檢測。 結果：

4、在多聚賴氨酸上培養(yǎng)的視網膜神經元免疫細胞化學染色顯示，培養(yǎng)的細胞大多數抗NF抗體反應陽性，NF陽性神經元所占總數神經元的90％以上。體外培養(yǎng)的正常視網膜神經元有EPOR的表達。低氧預適應后經半定量RT-PCR分析，EPO基因表達在1h達最高峰，以后隨時間的延長迅速下降，6h下降到接近正常的水平；而EPOR的表達在2h達到最高峰，約為正常對照組的4-5倍，以后雖然出現下降趨勢，但仍一直維持較高水平，提示低氧預適應后可上調神經元EPO、EP

5、OR表達，這可能是機體發(fā)生內源性視網膜保護的機制之一。同時，證實了外源性應用重組人促紅細胞生成素(rhEPO)預處理對神經元的缺氧損傷具有保護作用，在損傷前加入濃度在2.5-40U/ml的rhEPO均可有效抑制LDH釋放(P＜0.05)，而且具有濃度和時間依賴性；TUNEL結果顯示rhEPO預處理能抑制神經元的凋亡。此外，成功獲得視網膜Müller細胞，傳代后的細胞GFAP染色表現為胞漿內呈棕黃色的絲網狀結構，陽性細胞在95％以上，并發(fā)

6、現在正常的視網膜Müller細胞中僅見微弱的EPOmRNA和蛋白表達，而缺氧后表達明顯上調，這種上調呈時間依賴性。 結論：通過胰蛋白酶+EDTA聯合消化能很好得使視網膜細胞分離，視網膜神經元體外培養(yǎng)成功，并有較好的視網膜神經元生長。體外培養(yǎng)的正常視網膜神經元有EPOR的表達，低氧預適應后能夠明顯上調視網膜神經元EPO和EPOR表達，從而增強視網膜神經元對急性缺氧損傷的耐受能力。rhEPO預處理抑制神經元的缺氧損傷導致的細胞凋亡，