大鼠皮層神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分大鼠皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡的研究
　　目的：觀察大鼠皮層神經(jīng)元體外模擬缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡情況及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)變化。方法：體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠大腦皮層神經(jīng)元,神經(jīng)元特異性烯醇化酶免疫熒光染色法鑒定培養(yǎng)的神經(jīng)元純度,隨機(jī)分為正常對(duì)照組及缺血再灌注模型組,采用氧糖剝奪法建立模擬缺血再灌注神經(jīng)元模型。觀察體外培養(yǎng)的神經(jīng)元形態(tài),采用流式細(xì)胞儀AnnexinV-FITC、PI染色法檢測細(xì)胞凋亡率,Hoechst

2、33258染色后通過熒光顯微鏡觀察神經(jīng)元細(xì)胞核形態(tài)變化,Western-blot檢測神經(jīng)元GRP78、activecaspase12蛋白水平。結(jié)果：體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠皮層神經(jīng)元成功,神經(jīng)元純度在90％以上。模型組神經(jīng)元在再灌注6h后凋亡增加不顯著,但在12h、24h、48h均較正常對(duì)照組明顯增加,并隨著再灌注后時(shí)間的延長而逐漸上升。Hoechst33258染色可見凋亡細(xì)胞核致密濃染,熒光增強(qiáng)。模型組GRP78蛋白表達(dá)逐漸增多,在再灌注

3、后24h最多,但在48h時(shí)GRP78蛋白表達(dá)反而有下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著再灌注時(shí)間的延長,activecaspase12蛋白表達(dá)量逐漸增多,在48h時(shí)表達(dá)最多,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：體外原代培養(yǎng)神經(jīng)元采用氧糖剝奪損傷法,成功構(gòu)建了模擬缺血再灌注模型,該模型可見神經(jīng)元凋亡,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑介導(dǎo)了神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。
　　第二部分低分子肝素對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡的影響
　　目的

4、：觀察低分子肝素對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷后細(xì)胞凋亡的影響。方法：體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠大腦皮層神經(jīng)元,觀察體外培養(yǎng)神經(jīng)元形態(tài),神經(jīng)元特異性烯醇化酶免疫熒光染色法鑒定培養(yǎng)的神經(jīng)元純度。氧糖剝奪法建立模擬缺血再灌注神經(jīng)元模型。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺血再灌注模型組(缺血6h/再灌注24h)及低分子肝素干預(yù)組(缺血建模前2h給藥,分為0.1μg/ml、0.5μg/ml、2.5μg/ml、、5.0μg/ml組)。MTT法檢測各組神經(jīng)元光密度(O

5、D)值、計(jì)算細(xì)胞活力、篩選最佳藥物濃度。AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率,Hoechst33258染色觀察各組神經(jīng)元細(xì)胞核形態(tài)變化。結(jié)果：體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠皮層神經(jīng)元成功,神經(jīng)元純度在90%以上。模擬缺血再灌注后神經(jīng)元活力明顯下降,細(xì)胞凋亡率顯著增加,與正常對(duì)照組比較差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。0.1μg/ml濃度低分子肝素組神經(jīng)元活力與對(duì)照組比較無顯著差異,而濃度為0.5μg/ml、2

6、.5μg/ml、5.0μg/ml的低分子肝素組神經(jīng)元活力均比缺血再灌注組顯著增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Hoechst33258染色可見正常對(duì)照組細(xì)胞核呈彌散均勻藍(lán)光,缺血再灌注組凋亡細(xì)胞核致密濃染,熒光增強(qiáng),低分子肝素組凋亡細(xì)胞數(shù)量較缺血再灌注組明顯減少。結(jié)論：低分子肝素能提高體外培養(yǎng)神經(jīng)元氧糖剝奪損傷后的細(xì)胞活力,可降低神經(jīng)元凋亡,具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第三部分低分子肝素對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激神經(jīng)保護(hù)作用

7、機(jī)制的研究
　　目的：研究低分子肝素對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷后神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠大腦皮層神經(jīng)元,觀察體外培養(yǎng)神經(jīng)元形態(tài),神經(jīng)元特異性烯醇化酶免疫熒光染色法鑒定培養(yǎng)的神經(jīng)元純度。氧糖剝奪法建立模擬缺血再灌注神經(jīng)元模型。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺血再灌注模型組(缺血6h/再灌注24h)及低分子肝素干預(yù)組(缺血建模前2h給藥,0.5μg/ml)。Western-blot檢測神經(jīng)元bcl-2、bax、GRP78

8、和activecaspase12的蛋白水平。采用負(fù)載Fura-2/AM,雙波長熒光分光光度計(jì)法測定神經(jīng)細(xì)胞胞漿鈣離子濃度[Ca2+]i。結(jié)果：體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠皮層神經(jīng)元成功,其純度在90%以上。Western-blot結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,模型組的bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低,bax表達(dá)水平明顯升高,bcl-2/bax比值明顯下降,結(jié)果具有顯著性差異(P<0.01);與模型組相比,低分子肝素組bcl-2蛋白表達(dá)水平有明顯升高,b

9、ax蛋白表達(dá)有明顯下降,bcl-2/bax比值明顯升高,結(jié)果具有顯著性差異(P<0.01)。與對(duì)照組相比,模型組GRP78蛋白表達(dá)水平明顯升高,低分子肝素組GRP78蛋白表達(dá)水平最高,結(jié)果均具有明顯差異(P<0.05);與對(duì)照組相比,模型組activecasase12蛋白表達(dá)水平明顯升高,低分子肝素組activecasase12蛋白表達(dá)水平明顯降低,結(jié)果均具有明顯差異(P<0.05)。鈣離子濃度測定顯示:模型組[Ca2+]i與對(duì)照組相比