酪氨酸去磷酸化增強表皮生長因子受體在乳腺癌治療中靶向性的研究.pdf

1、目的：
　　設(shè)計實驗探討PTPH1對TKI類藥物與ER拮抗劑聯(lián)合用藥效果的影響，并針對上述一系列設(shè)想建立了課題思路。
　　方法：
　　為了檢驗上述假設(shè)，我們預(yù)先設(shè)計了三部分比較系統(tǒng)性的實驗。在第一部分實驗中，選用PTPH1過表達癌細胞、正常表達PTPH1的同細胞系癌細胞以及PTPH1敲低癌細胞株進行相關(guān)TKI抗癌藥物(拉帕替尼Lapatinib，吉非替尼Gefitinib)敏感性實驗，以檢測PTPH1表達水平對所選擇藥

2、物抗癌效果的影響。在第二部分實驗中，對相關(guān)細胞系進行有條件的培養(yǎng)，隨后用Western blot實驗檢測PTPH1是否可以調(diào)節(jié)相關(guān)抗癌藥物的靶向蛋白EGFR蛋白水平、穩(wěn)定性以及相關(guān)位點的磷酸化水平。最后第三部分研究計劃，包涵了一系列綜合實驗，包括Western blot、免疫沉淀、核漿分離實驗等對PTPH1調(diào)節(jié)EGFR的膜易位、ER的核內(nèi)易位以及ER與EGFR的相互作用進行了研究分析，同時這部分實驗可以綜合性地探討PTPH1是否能夠分別

3、調(diào)節(jié)EGFR蛋白水平和促進ER轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，從而增強相關(guān)靶向治療藥物（TKI類藥物和他莫昔芬Tamoxifen）對乳腺癌細胞的聯(lián)合抑制作用。上述實驗構(gòu)成了一整個體系，探討PTPH1對TKI類藥物（以及與他莫昔芬聯(lián)合用藥）的敏感性調(diào)節(jié)及其原理。
　　結(jié)果：
　　1.PTPH1提升了乳腺癌細胞對TKI類藥物的敏感性:PTPH1表達水平的提高特異性增強了MCF7、T47D以及MDA-MB-231(231)細胞對TKI類藥物（拉帕

4、替尼和吉非替尼）的敏感性;而在同類細胞系當(dāng)中，如果PTPH1蛋白被敲低會下調(diào)TKI類藥物的效果——PTPH1水平降低之后細胞耐藥性出現(xiàn)。PTPH1水平?jīng)Q定了癌細胞對TK1類藥物的抵抗。
　　2.PTPH1可以對EGFR在Y1173位點上進行去磷酸化。與PTPH1正常表達的對照組相比，PTPH1過表達細胞中Y1173位點的磷酸化水平明顯降低，而且這種去磷酸化作用也存在于體外293T細胞中;反之PTPH1敲低的細胞系的Y1173磷酸化

5、水平獲得上調(diào)。PTPH1對Y1173位點的去磷酸化依賴其自身催化能力，失去催化能力的PTPH1突變體PTPH1/S459A和PTPH1/DA沒有去磷酸化功能。
　　3.PTPH1可以上調(diào)EGFR蛋白表達水平:Western Blot證實在PTPH1過表達細胞中，EGFR的水平明顯高于PTPH1正常表達細胞;反之，癌細胞中的PTPH1敲低之后，EGFR水平隨之下降。PTPH1失去磷酸化功能的突變體PTPH1/S459A無法上調(diào)EGF

6、R蛋白。在體外293T細胞中，PTPH1上調(diào)EGFR蛋白的功能仍然存在。放線菌酮(Cycloheximide，CHX)實驗證實PTPH1上調(diào)EGFR蛋白的原因主要為增強EGFR蛋白的穩(wěn)定性;EGFR的突變體EGFR/Y1173F存在不依賴PTPH1的高穩(wěn)定性;PTPH1的突變體 PTPH1/S459A無法提高EGFR蛋白的穩(wěn)定性。泛素實驗證實PTPH1過表達導(dǎo)致泛素介導(dǎo)的EGFR蛋白降解減少;EGFR/Y1173F存在PTPH1非依賴性

7、泛素化降解減少。相關(guān)細胞集落實驗發(fā)現(xiàn)EGFR過表達明顯提高TKI的藥物作用;PTPH1過表達提升TKI藥物對腫瘤細胞的抑制作用;EGFR/Y1173F過表達導(dǎo)致了乳腺癌細胞對TKI藥物的耐藥性，而且這種耐藥性無法被PTPH1調(diào)節(jié)。最重要的是，免疫組化實驗證實在臨床標(biāo)本中，PTPH1與EGFR蛋白水平呈明顯的正相關(guān)。
　　4.PTPH1可以降低EGFR與ER的相互作用。核漿分離實驗證實，PTPH1不僅可以促進核內(nèi)ER水平提高，而且促

8、進了EGFR在細胞膜上的富集。免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn):PTPH1過表達可以降低EGFR與ER的結(jié)合，使EGFR-ER復(fù)合物水平降低;PTPH1/S459A無法降低EGFR與ER的相互作用。結(jié)合相關(guān)細胞集落實驗我們推測，EGFR與ER的相互作用可影響TKI藥物的作用。
　　5.ER的核內(nèi)蛋白水平升高導(dǎo)致EGFR與ER的相互作用減弱。免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn):細胞質(zhì)中的ER可以與EGFR相結(jié)合，產(chǎn)生EGFR-ER復(fù)合物;ER的突變體ER/T311A

9、核內(nèi)蛋白降低，與EGFR產(chǎn)生的復(fù)合物增加。相關(guān)細胞集落實驗顯示:ER/T311A過表達組與野生型ER過表達組相比，耐藥性增強。我們推測EGFR-ER復(fù)合物導(dǎo)致了細胞對TKI產(chǎn)生耐藥性。
　　6.PTPH1提高乳腺癌細胞對TKI與他莫昔芬(TAM)聯(lián)合用藥的敏感性。細胞集落實驗顯示:PTPH1過表達可以分別提高TKI類藥物或者他莫昔芬的作用;PTPH1過表達對于TKI與他莫昔芬聯(lián)合用藥效果的提升作用更為顯著;PTPH1的突變體一一沒

10、有去磷酸化作用的PTPH1/S459A無法提高乳腺癌細胞對TKI與他莫昔芬聯(lián)合用藥的敏感性。
　　結(jié)論：
　　1.PTPH1增加乳腺癌細胞對TKI類藥物的敏感性。
　　2.PTPH1在體外細胞和乳腺癌細胞中均可對EGFR在Y1173位點進行去磷酸化。
　　3.PTPH1通過對EGFR的Y1173位點的去磷酸化增加EGFR的穩(wěn)定性。
　　4.PTPH1通過催化活性降低EGFR-ER復(fù)合體的水平，從而提高TKI