膠質瘤干細胞免疫靶向治療比較實驗研究.pdf

1、目的意義:
　　膠質瘤作為一類常見的、多發(fā)的、對人類危害極大的惡性腦腫瘤，雖目前在手術、放療、化療等技術上已日漸完善，但病員仍具較高的傷殘率和病死率。
　　2004年，Singh等從膠質瘤中也分離出具有干細胞樣特征的細胞，從而證明了膠質瘤中TSC的存在，并將其命名為“膠質瘤干細胞(glioma stem cells，GSC)，其為腦腫瘤干細胞(brain tumor stemcells，BTSC)中的典型代表。
　　目

2、前為止，針對腫瘤干細胞的免疫治療大多集中在對皮膚、肝臟、胃腸、肺惡性腫瘤治療方面的研究，針對GSC靶向免疫治療膠質瘤方面的工作尚需完善。
　　因此，本課題首先選取了幾種不同的致敏DC方法（凍融裂解法，凋亡細胞法，全RNA提取法），以比較負載各種不同形式獲取的GSC抗原后，DC成熟程度和功能（包括DC增殖、表面共刺激分子表達和免疫活性細胞因子分泌功能）的相應狀態(tài);之后，再篩選出最佳的DC致敏方式，用于后續(xù)靶向殺傷膠質瘤細胞，尤其是殺

3、傷GSC的免疫治療實驗研究，期待能為免疫靶向殺傷GSC、提高膠質瘤治療效果提供可借鑒實驗依據(jù)。
　　研究內(nèi)容:
　　第一部分 GSC的分離純化及各種GC全抗原獲取
　　目的:
　　有效獲得分離純化的GSC及提取各種GC全抗原，為后續(xù)實驗研究奠基。
　　方法:
　　1、GSC的分離純化:參考美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culturecollection，ATCC)的培養(yǎng)方法培養(yǎng)小鼠

4、GL261膠質瘤細胞，接種于含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％CO2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。GL261膠質瘤細胞及GL261腫瘤球細胞經(jīng)免疫熒光細胞化學和流式細胞術檢測表面GFAP、CD133的表達，并進行GL261腫瘤干細胞球的分化試驗，鑒定為膠質瘤細胞(GC)和膠質瘤干細胞(GSC)。
　　2、GC全抗原的獲取:分別以凍融裂解法、凋亡細胞法和全RNA提取法提取GC的全抗原，

5、備以后續(xù)提呈給未成熟DC用。
　　結果:
　　實驗中所用腫瘤細胞經(jīng)anti-GFAP免疫熒光鑒定為小鼠GL261膠質瘤細胞系。通過無血清培養(yǎng)法結合流式細胞分選術，從小鼠的GL261膠質瘤細胞系中得到了較高純度（CD133表達率80.5±5.2％）的GSC。通過對GC進行凍融裂解、誘導凋亡、提取全RNA等處理，得到了純度、性質相對穩(wěn)定的凍融裂解抗原（蛋白濃度1.9～2.1 mg/ml）、凋亡細胞抗原（純度93.1±2.5％）和

6、全RNA抗原(OD260/280∶1.97～2.0)。
　　結論:
　　實驗中所用腫瘤細胞經(jīng)鑒定為小鼠GL261膠質瘤細胞系。通過無血清培養(yǎng)法結合流式分選，可從小鼠的GL261膠質瘤細胞系中得到較高純度的GSC。通過對GC進行凍融裂解、誘導凋亡、提取全RNA等處理，可得到純度、性質相對穩(wěn)定的凍融裂解抗原、凋亡細胞抗原和全RNA抗原。
　　第二部分 DC的誘導、培養(yǎng)、鑒定及最佳DC瘤苗的選擇及制備
　　目的:

7、>　　有效獲得DC及“GC和/GSC抗原+DC”瘤苗，并選出最優(yōu)致敏DC方式，用于后續(xù)免疫靶向GSC或GC治療實驗研究。
　　方法:
　　1、DC的誘導培養(yǎng)及鑒定:1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉C57小鼠后，將小鼠俯臥位固定于手術臺。消毒后剪開皮膚，顯露、分離并剔除小鼠雙下肢肌肉組織，于髖關節(jié)和踝關節(jié)處剪斷小鼠的股骨和脛腓骨并將其取出，保持無菌狀態(tài)。用5mL滅菌注射器抽取5mL不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。將針頭分別從兩端

8、插入骨髓腔，反復沖洗，得到小鼠骨髓組織。收集沖洗液離心后先后加入紅細胞裂解液對紅細胞進行充分裂解，繼而用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸于25cm2培養(yǎng)瓶，添加40ng/ml GM-CSF和40ng/mL IL-4，置于37℃，5％CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)流式細胞術檢測其表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ表達率，鑒定為未成熟DC。
　　2、GC/GSC抗原+DC瘤苗的制備:給上述得到的小鼠骨髓源性未成熟DC分別

9、負載以GC的凍融裂解抗原、凋亡抗原和全RNA抗原（分別對應第一部分中的三種GC全抗原提取方式），制成GC凍融裂解抗原+DC瘤苗、GC凋亡抗原+DC瘤苗和GC全RNA抗原+DC瘤苗。同時設立經(jīng)脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)刺激DC得到的LPS+DC疫苗為陽性對照組和未經(jīng)刺激的DC為陰性對照組，CCK-8法測各組DC增殖情況，流式細胞術檢測各組DC表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ表達率，ELISA測各組DC的免疫

10、活性細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10分泌量，以從中選出最佳致敏DC的方式，并以此最佳致敏方式制備GSC+DC瘤苗。
　　結果:
　　通過從同源的C57小鼠體內(nèi)原代取材，得到了小鼠的骨髓細胞，以GM-CSF+IL-4誘導成為未成熟的樹突狀細胞。
　　用所得的未成熟DC負載第一步中得到的三種GSC/GC全抗原及LPS，即可得到三種不同致敏方式的瘤苗和LPS+DC瘤苗（陽性對照）。陰性對照組DC不負載抗原

11、，稱為“對照組”
　　負載各種抗原后，LPS組和凋亡組DC增殖顯著高于凍融組及RNA組;凍融組、凋亡組和LPS組CD80、CD86、MHC-Ⅱ表達率均顯著高于RNA組(P＜0.05)，而凍融組、凋亡組和LPS組三組間無明顯差異(P＞0.05);凋亡組TNF-α分泌量顯著高于凍融組、RNA組和對照組(P＜0.05);凍融組和凋亡組IL-6分泌量顯著高于對照組和RNA組(P＜0.05);各組IFN-γ分泌量無顯著差異(P＞0.05);

12、凋亡組IL-10分泌量顯著低于凍融組、RNA組和LPS組(P＜0.05)。
　　結論:
　　最優(yōu)致敏DC方式為凋亡細胞法。該方式優(yōu)勢:抗原細胞量最小（即效率最高），使負載抗原后的DC高表達CD80、CD86和MHC-Ⅱ，并使其所分泌的細胞因子量變化（免疫活性性因子TNF-α和IL-6升高，免疫抑制性因子IL-10降低）最明顯。
　　第三部分 同源T淋巴細胞的制備及體外T細胞殺傷實驗
　　目的:
　　比較最佳

13、致敏方式下的“GC+DC”瘤苗與“GSC+DC”瘤苗，于靶向殺傷膠質瘤細胞、膠質瘤干細胞實驗中的療效。
　　方法:
　　1、各種GC全抗原的獲取同第一部分。
　　2、DC誘導、培養(yǎng)、鑒定及最優(yōu)致敏方式前提下的GSC+DC瘤苗和GC+DC瘤苗的制備同第二部分。
　　3、同源T淋巴細胞的制備:采用小鼠的外周血淋巴細胞分離液、分離培養(yǎng)C57小鼠的淋巴細胞，用添加IL-2的含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基維持培養(yǎng)

14、;經(jīng)流式細胞儀檢測其表面CD3分子的表達率后行磁珠分選，并于分選后再次檢測其表面CD3分子的表達率，鑒定所得T淋巴細胞的純度。
　　4、體外T細胞殺傷實驗:(1)以第一部分中培養(yǎng)的普通膠質瘤細胞株(GC)為靶細胞進行體外T淋巴細胞殺傷實驗，分為單純DC組、GC凋亡抗原+DC瘤苗組、GSC凋亡抗原+DC瘤苗組共3個組，效靶比（即經(jīng)各組瘤苗刺激后的T細胞數(shù)與GC細胞數(shù)之比）20∶1，行T淋巴細胞殺傷實驗，并計算T淋巴細胞對普通膠質瘤細

15、胞(GC)的殺傷率。(2)再以第一部分中分離提純的GSC為靶細胞進行體外T淋巴細胞殺傷實驗，同樣分為單純DC組、GC凋亡抗原+DC瘤苗組、GSC凋亡抗原+DC瘤苗組共3個組，分別與上述分離培養(yǎng)所得的同源T細胞混合培養(yǎng)，刺激激活T淋巴細胞，相應刺激后的3組T淋巴細胞再與分離提純的同源膠質瘤干細胞(GSC)共培養(yǎng)，效靶比（即經(jīng)各組瘤苗刺激后的T細胞數(shù)與GSC細胞數(shù)之比）20∶1，行T淋巴細胞殺傷實驗，并計算T淋巴細胞對膠質瘤干細胞(GSC)

16、的殺傷率。用LDH法測定T淋巴細胞對GC或GSC的殺傷情況，計算結果，進行組間比較。在以GC作為T細胞殺傷的靶細胞時，方差分析顯示差異有顯著性意義(P＜0.05)。
　　5、統(tǒng)計學分析:全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料實驗數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差”（(x)±SD）表示，常規(guī)進行方差齊性檢驗、正態(tài)性檢驗。單變量兩組資料之間的比較采用t檢驗，多組資料之間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異，有統(tǒng)計學意

17、義。
　　結果:
　　從同源C57小鼠取材得到的小鼠外周血單個核細胞懸液，經(jīng)磁珠分選、可獲得高純度的小鼠T淋巴細胞（CD3表達率90.3±1.7％）。
　　各組激活的T淋巴細胞對GC的殺傷率確有不同。
　　結論:
　　以凋亡細胞致敏法制備的GC+DC瘤苗和GSC+DC瘤苗，二者在體外T淋巴細胞殺傷實驗中，當以同源膠質瘤細胞系(GC)為靶時，殺傷效果未見顯著差異;但當以純化的GSC為靶時，GSC+DC瘤苗殺傷