CD基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞治療腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 探討大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的分離、培養(yǎng)、分化及鑒定的條件與方法；在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)染、篩選、擴(kuò)增、鑒定，獲取穩(wěn)定表達(dá)CD基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞；探討CD基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞離體及在體情況下對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，尋求膠質(zhì)瘤的基因治療新方法。 方法： 1.分離孕14～16dSD大鼠胚胎腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下區(qū)域NSCs，無血清培養(yǎng)基（DMEM/F12，含bFGF、EGF、B27等）條件下培養(yǎng)，通過有限稀釋法

2、克隆、傳代，含血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定神經(jīng)干細(xì)胞及分化后的細(xì)胞。 2.體外擴(kuò)增并酶切鑒定pCMVCD質(zhì)粒；采用Lipofectamine2000通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染NSCs，G418篩選陽性克隆，免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定重組子，檢測(cè)該真核表達(dá)載體的表達(dá)及轉(zhuǎn)染效率。 3.將NSCs/CD細(xì)胞與C6細(xì)胞共培養(yǎng)，在加入5-FC的情況下，觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；建立裸小鼠腦膠質(zhì)瘤原位動(dòng)物模型，隨機(jī)分

3、成試驗(yàn)組及對(duì)照組，移植NSCs/CD細(xì)胞后，腹腔注射5-FC，觀察NSCs/CD-5-FC自殺基因系統(tǒng)在活體內(nèi)對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制作用。 結(jié)果： 1.在本實(shí)驗(yàn)中，我們成功地分離并鑒定了孕14～16天SD大鼠胎鼠腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下的NSCs，并在體外培養(yǎng)增殖及分化。 2.pCMVCD質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)法成功轉(zhuǎn)染NSCs，G418篩選后可增殖形成抗性細(xì)胞克隆。免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果可見抗性細(xì)胞克隆表達(dá)NSCs的特異性抗原-nest

4、in，同時(shí)表達(dá)CD基因。 3.NSCs/CD細(xì)胞與C6細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，加入5-FC的情況下，與對(duì)照組相比較，均有顯著意義（P<0.01），能夠明顯抑制腫細(xì)胞的增殖，同時(shí)具有明顯的旁觀者效應(yīng)；成功建立裸小鼠腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，移植NSCs/CD細(xì)胞及腹腔注射5-FC后，可觀察到明顯的抗腫瘤作用。 結(jié)論： CD基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞的自殺系統(tǒng)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，效果顯著，不僅歸功于神經(jīng)干細(xì)胞的遷移能力、能夠遷移到膠質(zhì)瘤細(xì)胞周