Sirt1基因表達對豬脂肪分解的影響及其分子機制研究.pdf

1、Sirtl和ATGL在脂肪代謝中發(fā)揮著重要的作用。本研究在克隆豬Sirtl（pSirtl）和豬ATGL（pATGL）基因全長cDNA序列的基礎(chǔ)上，利用實時熒光定量PCR、RNA干擾（RNAi）和免疫組化等技術(shù)分別研究了pSirtl和豬脂肪代謝關(guān)鍵功能基因pATGL表達的組織特異性、表達規(guī)律及品種差異，探討了pSirtl對脂肪代謝關(guān)鍵功能基因表達的影響及其調(diào)控脂肪代謝的機理；并進一步研究了TNF-α和Insulin對pSirtl基因表達的

2、影響。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.pSirtl和pATGL基因全長cDNA序列克隆與序列分析
　　 通過RACE技術(shù)，克隆得到pSirtl和pATGL全長cDNA序列，pSirtl基因全長cDNA序列有4024bp（GenBank登錄號EU030283），其中包括15bp5’非編碼區(qū)（5'-untranslated region,5'-UTRs）、2226 bp編碼區(qū)（coding region,CDs）和1780 b

3、p的3’非編碼區(qū)（3'-UTR），編碼區(qū)翻譯742個氨基酸（GenBank登錄號ABS29571），分子量80.9 kDa，含有Sirtl蛋白家族的保守核心結(jié)構(gòu)域；BLAST結(jié)果表明，pSirtl氨基酸序列序列與人、狗、牛、鼠同源性分別達到87％，92％，91％和82％。pATGL全長cDNA序列1958 bp（GenBank登錄號EF583921），其中包括33 bp的5'-UTRs、1641 bp CDs和464 bp的3'-UTR

4、，編碼區(qū)翻譯486個氨基酸（GenBank登錄號ABS58651），分子量53.2 kDa，含有一個Patatin蛋白保守序列。BLAST結(jié)果表明，pATGL氨基酸序列與牛、小鼠、大鼠、狗、人的同源性達到87％、84％、83％、81％、80％。
　　 2.pSirtl和pATGL基因表達組織特異性、表達規(guī)律及品種差異研究
　　 組織特異性研究結(jié)果表明，pSirtl mRNA水平在腦中表達量最高，在皮下脂肪中次之；pATG

5、L在皮下脂肪中表達量最高。不同生長階段表達規(guī)律研究結(jié)果表明，在皮下脂肪中，pSirtl和pATGL基因表達隨著體重的增加而呈增加的趨勢；在腹脂和腸脂中，pSirtl和pATGL的表達規(guī)律不明顯。品種差異研究結(jié)果表明，在脂肪組織（皮下脂肪）中，金華豬pSirtl和pATGL基因表達量顯著低于長白豬，且與脂肪率成反比（金華豬脂肪率顯著高于長白豬）；在肌肉組織（背最長?。┲?，余華豬pSirtl和pATGL的表達量顯著高于長白豬，pSirtl和

6、pATGL基因表達與肌內(nèi)脂肪含量成正相關(guān)（金華豬肌內(nèi)脂肪顯著高于長白豬）。揭示，pSirtl和pATGL的表達與豬的脂肪代謝和肌內(nèi)脂肪沉積密切相關(guān)，且可能發(fā)揮著重要的作用。
　　 3.pSirtl對豬脂肪代謝關(guān)鍵功能基因表達的影響及其調(diào)控機制研究
　　 通過豬前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立，利用RNAi技術(shù)和pSirtl的抑制劑煙酰胺（NAM）及激動劑白藜蘆醇（RES）研究了pSirtl對脂肪代謝的影響及分子機理；并進一

7、步通過RNAi技術(shù)研究了pSirtl對脂肪代謝相關(guān)功能基因表達的影響及調(diào)控脂肪分解的分子機制。研究結(jié)果表明：豬脂肪細(xì)胞中，pSirtl和pATGL的基因表達隨著細(xì)胞的分化而逐漸升高，分別在第10d和8d時表達量最高。pSirtl的抑制劑NAM抑制pSirtl基因表達后，顯著下調(diào)pATGL和HSL基因的mRNA水平；同時促進了豬脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積，降低了培養(yǎng)基中甘油含量。用pSirtl激動劑RES激活pSirtl基因表達后，顯著提高pAT

8、GL和HSL基因表達；同時顯著抑制了豬脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積，增加培養(yǎng)基中甘油含量。表明，pSirtl可影響pATGL和HSL基因的表達，直接影響脂肪分解。篩選出了pSirtl和pATGL基因的有效siRNA表達載體RS3和RA1，經(jīng)干擾條件優(yōu)化后的干擾效果分別達到70％和60％左右。轉(zhuǎn)染pSirtl-siRNA干擾pSirtl基因表達后，顯著降低了pATGL和HSL基因的表達。RES50與pSirtl-siRNA協(xié)同作用研究結(jié)果也進一步表

9、明，pSirtl能正調(diào)控脂肪分解關(guān)鍵酶pATGL和HSL基因的表達。同時研究還發(fā)現(xiàn)，NAM抑制pSirtl基因表達后，能顯著提高PPARγ基因的表達，RES激活pSirtl基因表達后能顯著抑制PPARγ基因表達，干擾pSirtl后也能夠提高PPARγ基因的表達。上述結(jié)果揭示，pSirtl可通過正調(diào)控pATGL和HSL基因表達，進而降低脂滴沉積、促進脂肪分解；在此過程中，PPARγ可能發(fā)揮重要功能。
　　 4.TNF-α和Insu

10、lin對pSirtl基因表達調(diào)控研究
　　 研究結(jié)果表明，不同濃度TNF-α（1,12.5,25,50,100ng/ml）處理豬脂肪細(xì)胞24h和在25ng/ml的TNF-α濃度下處理不同時間（12,24,36,48h）后，顯著降低Sirtl基因表達和培養(yǎng)基中甘油水平；不同濃度Insulin（10,50,100,1000nM)處理豬脂肪細(xì)胞24h和在50nmol/L的Insulin濃度下處理不同時間（24,36,48h）后，也均能

11、顯著降低pSirtl基因的表達和培養(yǎng)基中甘油含量。揭示，一定濃度的TNF-α和Insulin處理脂肪細(xì)胞一定時間后，可以抑制pSirtl基因表達和脂肪細(xì)胞中的脂滴的分解。同時研究還發(fā)現(xiàn)，TNF-α和Insulin處理豬脂肪細(xì)胞后也均能顯著降低pATGL和HSL基因的表達。這進一步證實pSirtl調(diào)控脂肪分解可能是通過調(diào)控脂肪代謝關(guān)鍵酶pATGL和HSL基因表達實現(xiàn)的。Insulin和pSirtl-siRNA協(xié)同處理研究結(jié)果表明，Insu