SIRT1對阿霉素所致心肌損傷的保護(hù)作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:如何減輕阿霉素的心肌損傷既是心肌保護(hù)研究也是腫瘤防治研究共同關(guān)心的問題。阿霉素是一種臨床常用的蒽環(huán)類細(xì)胞周期非特異性腫瘤化療藥物,臨床上廣泛應(yīng)用于治療各種惡性腫瘤,但阿霉素用藥后不良反應(yīng)較多,最嚴(yán)重的是劑量依賴性的心臟毒性,不僅影響了患者的生存質(zhì)量,而且限制了阿霉素的臨床應(yīng)用。雖然國內(nèi)外對阿霉素心肌毒性作用的研究工作已經(jīng)取得了許多重要進(jìn)展,但其機(jī)制并未完全闡明。Sirtuin1(SIRT1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicoti

2、namide adenine dinucleotide,NAD)依賴的蛋白去乙?；?。研究表明,SIRT1對于心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展以及治療具有積極的意義。因此,為了尋找阿霉素心肌損傷新的防治“靶點(diǎn)”,本研究探討了SIRT1對阿霉素所致心肌損傷的影響及其分子機(jī)制。
　　方法:首先,我們構(gòu)建了阿霉素心肌損傷小鼠模型,通過觀察小鼠生存率的變化,檢測心臟血流動力學(xué)指標(biāo)的改變、心肌組織的氧化損傷程度、心肌細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C的釋放及心肌細(xì)

3、胞凋亡指數(shù),探討了SIRT1激動劑白藜蘆醇對阿霉素所致小鼠心肌損傷的影響。然后,我們利用基因轉(zhuǎn)染和RNA干擾技術(shù)過表達(dá)野生型SIRT1蛋白、過表達(dá)酶失活突變型SIRT1蛋白及抑制SIRT1蛋白的表達(dá),通過檢測大鼠心肌H9c2細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的水平、細(xì)胞存活率、線粒體跨膜電位的變化、線粒體細(xì)胞色素C的釋放及細(xì)胞凋亡,研究SIRT1對阿霉素所致H9c2細(xì)胞凋亡的影響。最后,我們通過

4、免疫共沉淀技術(shù)篩選了能夠與SIRT1發(fā)生相互作用的熱休克蛋白,并利用重組質(zhì)粒或shRNA干擾載體瞬時轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞以上調(diào)或抑制熱休克蛋白25(heat shock protein25,HSP25)的表達(dá),通過檢測線粒體細(xì)胞色素C的釋放、SIRT1與p53蛋白的結(jié)合、p53蛋白的乙?；郊凹?xì)胞凋亡等指標(biāo),研究了HSP25與SIRT1的相互作用關(guān)系對SIRT1蛋白功能的影響。
　　結(jié)果:首先,通過建立Balb/c小鼠阿霉素心肌損傷

5、模型,我們發(fā)現(xiàn)阿霉素處理組(DOX)小鼠第7w末生存率僅為65％,左心室功能明顯降低,心臟濕重、體重及心臟濕重/體重均明顯降低,而血清LDH水平、心肌羰基化蛋白水平和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平明顯增加,且心肌細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C釋放增多,凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)增加。然而,將白藜蘆醇按照15mg/kg體重劑量與阿霉素同時處理Balb/c小鼠7w后,自藜蘆醇+阿霉素處理組(R+D)小鼠第7w末生存率為90％,左心室功能明

6、顯改善,心臟濕重、體重及心臟濕重/體重雖較之正常對照組降低,但較之DOX組明顯改善。同時,血清LDH水平、心肌羰基化蛋白水平、MDA水平,心肌細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C的釋放,心肌細(xì)胞凋亡等均較之DOX組明顯降低。而且,R+D組較之DOX組的小鼠心肌SIRT1蛋白表達(dá)上調(diào)66.7％,小鼠心肌乙酰化p53蛋白占p53總蛋白的水平下降29.8％。此外,我們在細(xì)胞水平通過基因轉(zhuǎn)染和RNA干擾技術(shù)上調(diào)或下調(diào)SIRT1的表達(dá),探討了SIRT1對阿霉素所

7、致的細(xì)胞損傷的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染酶失活型突變體SIRT1(SIRT1-H363Y)和轉(zhuǎn)染SIRT1 shRNA的H9c2細(xì)胞與相應(yīng)對照組細(xì)胞比較,培養(yǎng)液中LDH的水平分別升高18.4％和25.2％,JC-1探針紅綠熒光的比值分別下降了53.1％和72.8％,線粒體細(xì)胞色素C的釋放分別增加了81.3％和45.2％,細(xì)胞凋亡指數(shù)分別增加了32.5％和50.8％。但是,轉(zhuǎn)染野生型SIRT1(SIRT1-WT)的H9c2細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載體的H9

8、c2細(xì)胞比較,細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的水平下降了23.3％,JC-1探針紅綠熒光的比值卻上升了349％,細(xì)胞色素C的釋放下降了43.8％,細(xì)胞凋亡指數(shù)減少了47.5％。最后,我們通過免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)SIRT1能夠與HSP25發(fā)生相互作用。通過構(gòu)建HSP25-Myc表達(dá)載體,并將SIRT1-Flag和HSP25-Myc表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)一步證實(shí)了SIRT1與HSP25相互作用關(guān)系的存在。在功能研究方面,我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HSP25不能減少DO

9、X所致的H9c2細(xì)胞凋亡,也不能抑制DOX所致的H9c2細(xì)胞細(xì)胞色素C的釋放,免疫共沉淀技術(shù)也證實(shí)HSP25與細(xì)胞色素C之間不存在可被檢測的相互作用關(guān)系。然而,抑制HSP25的表達(dá)卻使得DOX所致的H9c2細(xì)胞凋亡數(shù)量增加。并且,抑制HSP25的表達(dá)使去乙?；窼IRT1與p53的相互作用降低,進(jìn)而導(dǎo)致乙?；痯53蛋白水平的增加。
　　結(jié)論:白藜蘆醇能夠減輕阿霉素所致的小鼠心肌損傷和心衰程度,其分子機(jī)制可能與其激活去乙?；窼IR