米諾環(huán)素對視網(wǎng)膜感光細胞保護作用的實驗研究.pdf

1、隨著感染性眼病的控制，視網(wǎng)膜色素變性已經成為主要的致盲性眼病之一，其發(fā)病率約1/4000，全球患病者超過一百萬。雖然針對病因的基因治療是解決問題的根本，但由于RP的高度遺傳異質性，使得針對特定基因的治療手段不具有普遍性。而由于細胞凋亡已被證實為不同遺傳型RP中感光細胞死亡的共同通路。因此，抗凋亡治療成為RP治療的有力的作用位點。 米諾環(huán)素是屬于四環(huán)素家族的廣譜、二代半合成抗菌素，近年來由于在其藥效學上的新發(fā)現(xiàn)而受到神經科學者的關

2、注。人們首先注意到米諾環(huán)素的抗炎作用：對腦缺血性病變，米諾環(huán)素的應用可減輕病灶處小膠質細胞的活化和聚集。進一步的研究表明，米諾環(huán)素對慢性神經變性性疾病也具有治療作用，主要表現(xiàn)為抑制神經細胞的凋亡。鑒于大量動物模型的研究基礎，以及米諾環(huán)素多年來在抗菌方面的應用經驗，目前已經展開了針對肌萎縮性側索硬化、多發(fā)性硬化和亨廷頓病的臨床試驗。一些前期的小樣本研究表明米諾環(huán)素是安全并且有效的。 睫狀神經營養(yǎng)因子最初是從雞的眼球抽提物中分離出來

3、的一種能促進雞胚睫狀神經節(jié)細胞存活的蛋白質。研究發(fā)現(xiàn)，CNTF對多種神經元均具有保護作用。對于其作用機制，目前仍未能確定。已經提出的理論包括：抑制谷氨酸的興奮性毒性；調節(jié)神經膠質細胞；活化神經保護信號轉導通路等。 為評估米諾環(huán)素是否具有對視網(wǎng)膜感光細胞的保護作用，本研究首先觀察米諾環(huán)素對體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜原代神經細胞凋亡的作用，再以視網(wǎng)膜變性的動物模型--視網(wǎng)膜慢變性小鼠作為研究對象，觀察米諾環(huán)素治療的效果。此外，我們還嘗試將外源

4、性的神經保護藥物與內源性的神經營養(yǎng)因子結合應用，即在使用米諾環(huán)素的同時，通過基因轉移增加CNTF的表達。比較聯(lián)合治療與單純米諾環(huán)素應用的效果，分析聯(lián)合治療的可行性和必要性。 第一部分視網(wǎng)膜神經細胞培養(yǎng)及凋亡模型的建立 目的：原代培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經細胞，建立神經細胞凋亡模型。 材料和方法：取生后7天SD乳鼠，摘取眼球后分離視網(wǎng)膜，胰酶消化后接種于包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿中。接種次日加入阿糖胞苷抑制膠質細胞生長。細胞生長5

5、～7日行免疫組化鑒定，分別檢測NSE、Rhodopsin、GFAP和Lectin的表達。神經細胞凋亡模型采用1000M和1mM的谷氨酸誘導，MTT法檢測細胞存活率。以AnnexinV/PI的流式細胞儀檢測評估細胞凋亡。 結果：接種24小時后，大部分細胞貼壁生長。絕大部分細胞呈近圓形，胞體較小，折光性好。另可見小部分細胞呈不規(guī)則形，胞體大而扁平，生長于第一類細胞的下方。經免疫組化鑒定，前者為神經細胞，后者為神經膠質細胞。通過兩種抗

6、體的雙染，可見神經細胞中大部分為視桿細胞。培養(yǎng)細胞中約80％為視桿細胞；10％為神經膠質細胞，偶見小膠質細胞。100μM和1mM的谷氨酸都可引起細胞的死亡，MTT法得到的光密度均值：正常對照組，0.093±0.008；低濃度谷氨酸組，0.043±0.006；高濃度谷氨酸組，0.037±0.008。正常組與兩個谷氨酸組之間存在顯著性差異，兩個谷氨酸組之間不存在顯著性差異。采用1mM谷氨酸作用1小時后，AnnexinV/PI檢測可見凋亡細胞

7、比例由0.3％升高至7.7％。 結論：采用酶消化法原代培養(yǎng)視網(wǎng)膜細胞，并以阿糖胞苷抑制神經膠質細胞，可得到以神經細胞為主的視網(wǎng)膜細胞。100μM和1mM谷氨酸均可有效誘發(fā)凋亡，其中1mM谷氨酸作用1小時后，即可檢測到神經細胞凋亡顯著增多。 第二部分米諾環(huán)素對體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經細胞的抗凋亡作用 目的：觀察米諾環(huán)素對抗谷氨酸誘導的神經細胞凋亡的效果，分析其作用機制。 方法：原代培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經細胞，分為正常對照

8、組、米諾環(huán)素對照組、谷氨酸對照組和米諾環(huán)素治療組。干預1小時后行AnnexinV/PI流式細胞儀檢測，計數(shù)凋亡細胞數(shù)量；RT-PCR檢測caspase-3的mRNA水平，流式細胞儀檢測Rh123評估線粒體膜電位。干預12小時后行MTT檢測細胞活性；取細胞培養(yǎng)上清做一氧化氮合酶(NOS)的活力單位檢測。 結果：干預1小時后，AnnexinV/PI流式細胞儀檢測凋亡細胞比例：正常對照組，5.1％；米諾環(huán)素對照組，4.3％；谷氨酸對照

9、組，15.2％；米諾環(huán)素治療組，8.3％。Caspase3各組水平：正常對照組，0.28±0.07；米諾環(huán)素對照組，0.36±0.06；谷氨酸對照組，0.92±0.11；米諾環(huán)素治療組，0.58±0.08。干預12小時后，MTT檢測各組細胞吸光度均值：正常對照組，0.093±0.008；米諾環(huán)素對照組，0.099±0.012；谷氨酸對照組，0.0378±0.008；谷氨酸+米諾環(huán)素治療組，0.08775±0.016。經統(tǒng)計，正常組與治療

10、組之間無顯著性差異，谷氨酸對照組與其他各組之間均有顯著性差異。流式細胞儀檢測Rh123，得出各組陽性率。正常對照組，67.1％；米諾環(huán)素對照組，54.2％；谷氨酸對照組，27.5％；米諾環(huán)素治療組，32.4％。NOS活力單位檢測，以其他各組與正常組的比值進行統(tǒng)計，均數(shù)為：正常對照組，1；米諾環(huán)素對照組，0.987±0.219；谷氨酸對照組，1.513±0.472；米諾環(huán)素治療組，1.176±0.259。其中谷氨酸對照組與其他三組之間有顯

11、著性差異。 結論：20μM米諾環(huán)素可顯著減輕谷氨酸誘導的神經細胞凋亡，其作用機制與抑制caspase-3的表達，穩(wěn)定線粒體膜電位，以及抑制NOS活性有關。 第三部分米諾環(huán)素對rds鼠視網(wǎng)膜感光細胞凋亡的拮抗作用 目的：觀察米諾環(huán)素腹腔注射對視網(wǎng)膜慢變性小鼠視網(wǎng)膜感光細胞凋亡的治療效果。 材料和方法：實驗動物分為3組。米諾環(huán)素治療組與陽性對照組為日齡匹配的rds小鼠。米諾環(huán)素組于生后7天開始腹腔注射米諾環(huán)素

12、，每日50mg/kg。陽性對照組小鼠不作干預。正常對照組為日齡匹配的C3B小鼠。三組小鼠分別于P18，P25，P35及P45時處死，摘取眼球。檢測指標如下：P18的視網(wǎng)膜切片原位細胞凋亡檢測；P45的視網(wǎng)膜切片外核層厚度測量；各時間點視網(wǎng)膜切片HE染色；各時間點的視網(wǎng)膜切片F(xiàn)4/80免疫組化檢測。 結果： 1.原位細胞凋亡檢測：正常對照組視網(wǎng)膜未見陽性細胞。治療組與陽性對照組的視網(wǎng)膜切片均可在外核層發(fā)現(xiàn)陽性染色細胞，治療

13、組較陽性對照組數(shù)量明顯減少。 2.形態(tài)學觀察：正常對照組視網(wǎng)膜各層結構完整，外核層細胞有9～10層，其外側依次為感光細胞內節(jié)與外節(jié)。治療組及陽性對照組視網(wǎng)膜結構相似，各時間點視網(wǎng)膜外節(jié)均缺如；外核層細胞層數(shù)隨小鼠日齡增長逐漸減少。其中陽性對照組由P18的9～10層減少到P45的6～7層；而治療組視網(wǎng)膜在P45時有7～8層。P45時，距視乳頭200μm處ONL厚度：治療組，40.85±2.89μm；陽性對照組，33.31±4.47

14、μm；正常對照組，48.89±2.18μm。距視乳頭600pro處ONL厚度：治療組，39.90±3.19μm；陽性對照組，28.96±3.34μm；正常對照組，35.62±2.68μm。治療組與陽性對照組間有顯著性差異。 3.視網(wǎng)膜F4/80免疫組織化學檢查：正常對照組可見視網(wǎng)膜內層散在陽性細胞。陽性對照組可見分布于視網(wǎng)膜各層的陽性染色，視網(wǎng)膜下腔亦見陽性細胞。治療組視網(wǎng)膜陽性染色相對較少，大部分局限于視網(wǎng)膜內層，偶見于外叢狀

15、層，外核層及視網(wǎng)膜下腔均未見陽性細胞。 結論：米諾環(huán)素治療可減少視網(wǎng)膜慢變性小鼠的感光細胞凋亡數(shù)量，延緩外核層變薄的發(fā)展。 第四部分米諾環(huán)素聯(lián)合CNTF基因轉移對rds鼠感光細胞凋亡的拮抗作用 目的：觀察米諾環(huán)素與CNTF基因轉移聯(lián)合應用拮抗rds鼠視網(wǎng)膜感光細胞凋亡的效果，并與單純應用米諾環(huán)素的效果進行比較，探討聯(lián)合治療的必要性。 材料和方法：rds小鼠于P7開始每日腹腔注射米諾環(huán)素50mg/kg。P1

16、0小鼠右眼接受單次的玻璃體腔注射攜帶睫狀神經基因的重組腺相關病毒，作為聯(lián)合治療組；左眼不做處理，作為單一治療組。兩組動物分別于P18，P25，P35及P45時處死，摘取眼球。檢測指標如下：RT-PCR檢測CNTF的mRNA表達；免疫組化檢測CNTF在視網(wǎng)膜的表達；P18的視網(wǎng)膜切片原位細胞凋亡檢測；P45的視網(wǎng)膜切片外核層厚度測量；各時間點視網(wǎng)膜切片HE染色。 結果： 1.RT-PCR：除P18兩組間無顯著性差異外，轉染

17、AAV-CNTF的聯(lián)合治療組CNTF的mRNA表達較單一治療組顯著增高，表明轉染的基因在mRNA水平得到有效表達。 2.視網(wǎng)膜CNTF免疫組織化學檢查：單一治療組陽性染色基本見于視網(wǎng)膜內層，其中神經纖維層染色呈短索狀，與視網(wǎng)膜平面平行；內叢狀層染色呈細條狀，與視網(wǎng)膜平面垂直；內核層散在陽性細胞。隨時間延長無明顯變化。聯(lián)合治療組可見視網(wǎng)膜陽性染色分布與單一治療組相近，但數(shù)量較多，且隨時間延長逐漸增多，提示CNTF表達大致位于神經膠

18、質細胞，轉染后表達增加。 3.P45時，距視乳頭200μm處ONL厚度：單一治療組，40.85±2.89μm；聯(lián)合治療組，45.39±3.32μm。距視乳頭600μm處ONL厚度：單一治療組，39.90±3.19μm；聯(lián)合治療組，41.48±2.80μm。200μm處兩者有顯著性差異。 結論：AAV-CNTF轉染后可顯著提高視網(wǎng)膜CNTF的表達；米諾環(huán)素與CNTF聯(lián)合應用，可有效延緩rds鼠視網(wǎng)膜變性，其效果優(yōu)于米諾環(huán)素