不結(jié)球白菜抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的克隆及耐熱耐寒相關(guān)蛋白的功能鑒定.pdf

1、干旱、鹽害、極端溫度、化學(xué)毒害和氧化脅迫等非生物脅迫嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，并導(dǎo)致環(huán)境退化。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，需要對(duì)各種逆境和發(fā)育信號(hào)作出反應(yīng)，這就要求對(duì)各種功能基因的表達(dá)進(jìn)行精確調(diào)控。植物在感受環(huán)境脅迫信號(hào)后，會(huì)激活相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)大量脅迫應(yīng)答基因表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)的脅迫應(yīng)答反應(yīng)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)以及DNA結(jié)合活性等特點(diǎn)，將其分成若干個(gè)家族，如NAC、Myb、HSF、bZIP等，這些轉(zhuǎn)錄因子在脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

2、 本研究利用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技術(shù)從不結(jié)球白菜cDNA文庫(kù)中克隆到1個(gè)新的編碼NAC類轉(zhuǎn)錄因子的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為BrNAC。BrNAC基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)由837bp組成，編碼1個(gè)由278個(gè)氨基酸組成的NAC類轉(zhuǎn)錄因子。推導(dǎo)的氨基酸序列與油菜NAC5-8有97％的同源性，與油菜NAC5-7，NAC3同源性分別為92％和86％，與擬南芥ATAF2的同源性達(dá)89％。二級(jí)

3、結(jié)構(gòu)分析表明BrNAC具有許多其它NAC家族的共同特性。構(gòu)建的同源進(jìn)化樹(shù)表明，BrNAC在進(jìn)化關(guān)系上與AFAF2亞族轉(zhuǎn)錄因子最近。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)BrNAC基因在不同組織中以及不同逆境脅迫下相對(duì)的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明，BrNAC基因的表達(dá)在莖、葉中最高，并且受冷和機(jī)械損傷和高鹽的誘導(dǎo)，而與NAA和ABA的關(guān)系不大。 利用基于PCR的兩步PTDS方法(PCR-based two-step DNA synthes

4、is，PTDS)技術(shù)成功的合成了來(lái)源于白楊SP1基因和昆蟲的抗凍肽ThpI基因。PTDS基因合成方法，是一個(gè)較為簡(jiǎn)單，高效，高保真度，低成本的基于兩步PCR方法合成長(zhǎng)DNA序列方法.同以前的合成方法比較，該P(yáng)TDS還具有時(shí)間短，通常是6到7天，該方法還比較容易獲得不同種類，不同長(zhǎng)度，甚至大于6kb的DNA片段，適合高GC比，高度重復(fù)序列，復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA合成。因而，PTDS方法提供了一個(gè)能夠合成不同種類、具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)片段基因的可

5、行的技術(shù)。 為了進(jìn)一步分析SP1基因扣ThpI基因的功能，本研究構(gòu)建了農(nóng)桿菌-植物雙元表達(dá)載體，通過(guò)蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)SP1基因和ThpI基因的擬南芥植株。結(jié)果表明，過(guò)量表達(dá)SP1基因的擬南芥獲得了很明顯高溫抗性。通過(guò)檢測(cè)野生型和轉(zhuǎn)SP1基因的擬南芥的葉綠素含量、葉綠素?zé)晒?、含水量、脯氨酸及MDA含量等多種生理指標(biāo)，驗(yàn)證了SP1基因過(guò)量表達(dá)提高擬南芥高溫抗性的生理機(jī)制；過(guò)量表達(dá)ThpI基因的擬南芥提高了植物的低溫抗性，通過(guò)