不結(jié)球白菜株型性狀相關(guān)基因挖掘及分析.pdf

1、白菜類作物隸屬十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)，原產(chǎn)自我國(guó)，栽培歷史悠久且品種豐富，主要包括大白菜（Brassica rapa ssp.pekinensis）、不結(jié)球白菜(B.rapa ssp.chinensis; Non Heading Chinese Cabbage; NHCC)和蕪菁（B.rapa ssp.rapa）。其中，不結(jié)球白菜是我國(guó)長(zhǎng)江中下游廣泛種植的大眾蔬菜。不結(jié)球白菜包含了多個(gè)變種，具有豐富的

2、形態(tài)多樣性。在多個(gè)變種中，存在不同的株型性狀，如直立、半塌地和塌地。而在直立株型中，又包含直立不束腰和直立束腰株型。在本試驗(yàn)中，利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)直立束腰和半塌地品種雜交構(gòu)建的F2分離群體進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)利用轉(zhuǎn)錄組和MeDIP測(cè)序技術(shù)對(duì)束腰品種進(jìn)行束腰前后的株型差異基因挖掘。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)候選基因中生長(zhǎng)素信號(hào)途徑中的Aux/IAA及ARF家族在大白菜中進(jìn)行鑒定和進(jìn)化分析;對(duì)脫落酸信號(hào)途徑中的SnRK2基因家族在不結(jié)球白菜中進(jìn)行克隆

3、和分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.使用直立束腰品種和半塌地品種進(jìn)行雜交，構(gòu)建F2分離群體，來(lái)進(jìn)一步測(cè)量束腰性狀及其與其它性狀之間的關(guān)系。結(jié)果證明，束腰性狀并非質(zhì)量性狀，而是在植株成長(zhǎng)過(guò)程中逐漸形成的數(shù)量性狀。在兩個(gè)組合的F2分離群體中，通過(guò)測(cè)量計(jì)算植株的腰粗和菜頭粗的比值得到的束腰比呈正態(tài)分布。并且，植株的束腰比與植株的株高、葉柄長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)。在束腰形成過(guò)程中，與低溫處理的植株相比，處于18℃-24℃環(huán)境中的植株幾乎不束腰，這說(shuō)明

4、低溫積溫與束腰性狀的形成有關(guān)。
　　2.以大白菜基因組為參考基因組，對(duì)兩個(gè)株型性狀表現(xiàn)極端的親本構(gòu)建的F2分離群體進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，共獲得78，723，756條有效reads，GC含量約42％，終獲得具有1個(gè)或多個(gè)等位基因的SLAF標(biāo)簽62，978個(gè)，整體平均深度達(dá)414.26x，且SLAF標(biāo)簽在染色體上分布均勻。實(shí)驗(yàn)中定位到了3個(gè)較可靠區(qū)域，包含8810個(gè)SNP標(biāo)簽，148條候選基因。根據(jù)不結(jié)球白菜變種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到25條

5、表達(dá)差異較大的基因，其中11條是F-box基因。選定的25條基因在束腰形成前后的樣品中表達(dá)差異較大。
　　3.利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和MeDIP測(cè)序方法，對(duì)不結(jié)球白菜束腰前后的基因進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析。在本研究中，轉(zhuǎn)錄組共得到103，846，926個(gè)高質(zhì)量的雙末端序列，比對(duì)到參考基因組上的大概約70％，得到上調(diào)差異基因1560條，下調(diào)基因1228條。MeDIP測(cè)序共測(cè)得223，380，998個(gè)長(zhǎng)為49bp的雙末端序列，與參考基因組的比對(duì)率分

6、別是78.01％和78.13％。測(cè)序結(jié)果表明，在束腰過(guò)程中，基因組甲基化水平提高。兩種測(cè)序聯(lián)合分析后，共鑒定出基因主體負(fù)相關(guān)的基因123條，啟動(dòng)子負(fù)相關(guān)基因387條。其中代謝相關(guān)途徑、次生代謝途徑、植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及植物病原互作途徑所占比例較高。最終在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中共選出14條候選基因并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。
　　4.在不結(jié)球白菜束腰性狀的轉(zhuǎn)錄組及甲基化聯(lián)合分析中，鑒定出部分生長(zhǎng)素響應(yīng)基因Aux/IAA及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基

7、因ARF。本研究在大白菜中共鑒定出52條Aux/IAA和33條ARF基因，其中包括1條ARF類似基因，命名為AL。這些基因分化時(shí)間與大白菜三倍化時(shí)間基本一致。在全基因組加倍后，Aux/IAA基因被全部保留下來(lái)，遠(yuǎn)優(yōu)先于ARF基因。在陸地植物進(jìn)化過(guò)程中，ARF基因擴(kuò)增平緩穩(wěn)定，Aux/IAA基因家族擴(kuò)增迅速且受到的選擇壓力較小。Aux/IAA基因家族表現(xiàn)出了更強(qiáng)的組織表達(dá)特異性，重復(fù)基因的功能發(fā)生了分化。在研究中鑒定出的AL基因廣泛存在于

8、植物中，并與ARF關(guān)系更近。
　　5.轉(zhuǎn)錄組及甲基化聯(lián)合分析中的候選基因SnRK2.6屬于SnRK2基因家族。本研究結(jié)果表明該家族在進(jìn)化過(guò)程中被優(yōu)先保留，并在不結(jié)球白菜逆境文庫(kù)中克隆到13條SnRK2基因。這些基因多數(shù)含有8個(gè)外顯子，結(jié)構(gòu)保守穩(wěn)定。大部分基因，尤其是第三亞組參與了ABA調(diào)控。除此之外，大部分基因還可響應(yīng)冷處理。BcSnRK2.6a則是唯一可同時(shí)響應(yīng)ABA與低溫的BcSnRK2。BcSnRK2的表達(dá)模式說(shuō)明其協(xié)同參與