CD73在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)分子機(jī)制研究.pdf

1、一、背景
　　CD73是一種分子量為70kDa的多功能跨膜糖蛋白,通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)[1]錨定在細(xì)胞膜上。既往的研究表明,CD73在多種疾病中發(fā)揮多種不同生物學(xué)功能。CD73既具有細(xì)胞外水解酶的活性,如CD73可將細(xì)胞外的AMP水解成腺苷,腺苷再通過和四種不同親和力的腺苷受體結(jié)合,參與多條不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,起到抑制血小板的聚集、抗炎癥反應(yīng)、免疫抑制等。同時,CD73還具有非水解酶的活性,近年較多報道指出,在乳腺癌、前列腺

2、癌、惡性膠質(zhì)瘤、膀胱癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞中CD73的表達(dá)及活性顯著升高[2]。有報道指出CD73在惡性黑色素瘤內(nèi)高表達(dá),并且CD73的高表達(dá)與其高侵襲性成正相關(guān)[3]。Rikke Leth-Larsen則報道了在高度惡性乳腺癌細(xì)胞的 CD73 mRNA水平和CD73活性均顯著高于低度惡性細(xì)胞[4],在進(jìn)行了體外實驗檢測后發(fā)現(xiàn),CD73可以促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動力和侵襲力,提示CD73在乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用。盡管如此,

3、CD73在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制仍未闡明。CD73在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系仍然不清楚。
　　腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤患者死亡的重要原因,而惡性腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動、遷移、和侵襲貫穿于腫瘤轉(zhuǎn)移的全過程,是腫瘤發(fā)生發(fā)展中最基本的生物學(xué)行為。鑒于此,我們預(yù)實驗首先運(yùn)用免疫組化檢測了CD73在臨床組織標(biāo)本中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比其結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá),并且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(C、D期)的病人組織標(biāo)本中顯著高表達(dá)于

4、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,在隨后通過RT-PCR及Western Blot檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞系 CD73mRNA和蛋白水平的表達(dá)時,發(fā)現(xiàn)其在具有高侵襲潛能的細(xì)胞株中( Lovo、KM12)呈高表達(dá)。在用 CD73特異性抑制劑αβ-亞甲基二磷酸腺苷(α-methyleneADP,APCP)作用于細(xì)胞系后,通過劃痕實驗及Transwell小室侵襲實驗檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞運(yùn)動、遷移、及侵襲能力均有不同程度下降,由此初步判斷CD73與細(xì)胞的運(yùn)動、遷移有關(guān),但其具體

5、作用及條件機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此,本研究擬通過觀察 CD73對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲力和運(yùn)動力的影響,探討 CD73在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過程中的作用及其機(jī)制,為進(jìn)一步研究其在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)治療中的作用奠定實驗基礎(chǔ)。
　　二、目的
　　明確CD73在不同分期的結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)分布及其與臨床病理參數(shù)、患者預(yù)后之間的相關(guān)性,以及 CD73分子對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用,進(jìn)一步闡明CD73促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機(jī)制。<

6、br>　　三、材料與方法
　　1.采用免疫組化檢測臨床組織標(biāo)本中結(jié)腸癌組織中CD73的分布與表達(dá)、并分析CD73的表達(dá)與各臨床各病理參數(shù)的相關(guān)性,進(jìn)一步運(yùn)用Kaplan Meier生存曲線分析及多因素Cox回歸模型預(yù)測CD73是否可以作為一個獨立判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的因子。采用 WB、RT-PCT檢測手術(shù)后新鮮結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織和不同侵襲潛能的結(jié)直腸癌細(xì)胞系中CD73蛋白及mRNA水平的表達(dá)。
　　2.體外采用特異性

7、抑制劑、RNA干擾和基因過表達(dá)的方法,抑制結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞CD73及上調(diào)RKO細(xì)胞的CD73表達(dá),利用定量PCR、Western blot檢測驗證干擾及過表達(dá)后Lovo和RKO中CD73蛋白表達(dá)水平的改變,劃痕實驗、Transwell侵襲小室、細(xì)胞粘附實驗體外檢測上述CD73蛋白抑制或表達(dá)重建后Lovo和RKO細(xì)胞的ATP/ADP比值、運(yùn)動、遷移、侵襲及粘附能力的改變。裸鼠體內(nèi)移植瘤全身轉(zhuǎn)移模型檢測 CD73干擾后腫瘤轉(zhuǎn)移能力的改變。

8、
　　3.采用激光共聚焦觀察CD73蛋白與阿糖腺苷受體A1R、A2AR、A2BR、A3R的共表達(dá)情況。定量 PCR、WB檢測 CD73干擾后、其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的阿糖腺苷受體A1R、A2AR、A2BR、A3R的mRNA和蛋白表達(dá)。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CD73RNAi的Lovo細(xì)胞加入四種受體特異性激動劑后進(jìn)行回復(fù)實驗,利用 Transwell侵襲小室實驗檢測分別用四種特異性受體激動劑刺激下游受體表達(dá)后結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力的改變。

9、r>　　四、結(jié)果
　　1. CD73表達(dá)于結(jié)直腸癌細(xì)胞膜表面,396例的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中,CD73陽性表達(dá)率為57.1％(226/396)。與癌旁正常結(jié)直腸組織相比,CD73在結(jié)直腸癌中的表達(dá)顯著增高,并且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中CD73表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)。CD73的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.020)、腫瘤分期成正相關(guān)(P=0.004),與患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤分化程度等

10、無顯著相關(guān)性。通過Kaplan Meier生存曲分析結(jié)果表明CD73低表達(dá)的早期結(jié)直腸癌患者預(yù)后顯著好于高表達(dá)患者。多因素Cox模型分析發(fā)現(xiàn),CD73可以作為一個新的獨立預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的因子。新鮮手術(shù)標(biāo)本結(jié)直腸癌組織中CD73mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于其配對癌旁組織,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。CD73在具有高侵襲潛能的結(jié)直腸癌細(xì)胞LOVO、KM12中有較高水平的表達(dá),而在RKO、DLD1等細(xì)胞系中CD73的表達(dá)水平較低。
　

11、　2.用CD73的特異性免疫抑制劑抑制Lovo和KM12細(xì)胞中的CD73表達(dá)后,劃痕實驗和transwell侵襲小室結(jié)果顯示,Lovo和KM12細(xì)胞的運(yùn)動、遷移及侵襲能力均下降。構(gòu)建CD73mRNA干擾慢病毒載體并成功轉(zhuǎn)染至Lovo細(xì)胞后,劃痕實驗和transwell侵襲小室、粘附實驗結(jié)果表明,Lovo細(xì)胞的運(yùn)動、遷移、侵襲及粘附能力顯著下降(P<0.01)。構(gòu)建CD73mRNA過表達(dá)慢病毒載體并成功轉(zhuǎn)染至RKO細(xì)胞后,劃痕實驗、tra

12、nswell侵襲小室及粘附實驗結(jié)果表明,RKO細(xì)胞的運(yùn)動、遷移、侵襲及粘附能力顯著升高(P<0.01)。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示,CD73可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞移植瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。
　　3. CD73蛋白與A2AR、A2BR均存在著共表達(dá),但在干擾沉默CD73表達(dá)后,阿糖腺苷 A2BR受體 mRNA及蛋白水平均下降,并且細(xì)胞的遷移、侵襲能力下降,而A2ARmRNA及蛋白水平均未見明顯改變。在用A2BR的特異性激動劑激活A(yù)2BR受體后可以逆轉(zhuǎn)性

13、增強(qiáng)由沉默CD73表達(dá)后的Lovo細(xì)胞遷移及侵襲能力。
　　五、結(jié)論
　　1.與癌旁正常結(jié)直腸組織相比,CD73在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)顯著增高。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中CD73表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者,并且CD73的高表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。CD73可作為早期結(jié)直腸癌患者的預(yù)后指標(biāo)之一。
　　2.體內(nèi)體外實驗均證實CD73具有促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移作用。
　　3. CD73通過調(diào)控A2BR的表