慢病毒載體介導(dǎo)的CXCR7shRNA對結(jié)腸癌生物學行為的影響.pdf

1、惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程涉及多個趨化因子和受體的異常表達，CXCL12和受體CXCR4是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子。最近在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)僅抑制CXCR4的表達，只能部分地阻斷惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CXCR7(孤兒受體RDCl)與CXCL12具有高親和力，表達于許多腫瘤細胞系，直接參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CXCR7信號傳導(dǎo)機制還不確切，推測可能是通過結(jié)構(gòu)性激活機制來活化細胞，此結(jié)構(gòu)性激活機制通過可逆性地與配體結(jié)合的形式活

2、化。 體外實驗證實CXCR7能提高腫瘤細胞的生長、粘附和侵襲能力。導(dǎo)入CXCR7序列的乳腺癌細胞MDA-MB435s，體內(nèi)成瘤性顯著提高；而CXCR7siRNA可使乳腺癌細胞4T1體內(nèi)成瘤性顯著降低。用CXCR7的小分子拮抗劑也可使腫瘤生長顯著減小。 目前研究CXCR7對腫瘤生物學行為的影響僅限于乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌等。本文擬展開“CXCR7與結(jié)腸癌”的實驗研究，首先假定CXCR7是人結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的促進因子，

3、在結(jié)腸癌組織中高表達，并與結(jié)腸癌細胞的增殖、遷移相關(guān)，靶向沉默CXCR7的表達能有效抑制結(jié)腸癌的惡性進展，由此實驗研究設(shè)計如下： 1.研究CXCR7在人結(jié)腸癌組織、正常結(jié)腸組織以及結(jié)腸癌細胞系中的表達，探討其表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤分化程度的關(guān)系。 2.設(shè)計、篩選有效抑制人結(jié)腸癌細胞CXCR7表達的siRNA序列，并構(gòu)建重組慢病毒CXCR7shRNA(lentiviraus-CXCR7shRNA，LV-CXCR7sh

4、RNA)表達載體。 3.研究靶向CXCR7的慢病毒shRNA表達載體對人結(jié)腸癌細胞增殖、遷移活性的調(diào)節(jié)作用，從細胞水平探討CXCR7對結(jié)腸癌的生物學行為的影響。 4.研究靶向CXCR7的慢病毒shRNA表達載體對人結(jié)腸癌荷瘤裸鼠瘤體的治療作用，在動物體內(nèi)進一步證實CXCR7對結(jié)腸癌的生物學行為的影響。 第一章 CXCR7在人結(jié)腸癌組織和結(jié)腸癌細胞系中的表達及其意義 目的 研究CXCR7在人結(jié)腸癌組

5、織、正常結(jié)腸組織以及結(jié)腸癌細胞系中的表達水平。 方法 1.CXCR7在人結(jié)腸癌組織中的表達水平：分別采用實時熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)和Westernblotting(WB)方法測定人結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織中CXCR7mRNA和蛋白的表達水平，結(jié)合臨床資料分析CXCR7的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度的關(guān)系。 2.CXCR7在

6、人結(jié)腸癌細胞系中的表達水平：FQ-PCR方法測定CXCR7mRNA在2種人結(jié)腸癌細胞系HT-29和SW480中的表達水平，選擇其中CXCR7表達較高的一株結(jié)腸癌細胞進入后續(xù)部分的實驗。 結(jié)果 1.人結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織中CXCR7mRNA相對表達的中位數(shù)分別為1.14和0.22，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)腸癌組織中CXCR7蛋白的相對表達量為0.245±0.059，與正常結(jié)腸組織中的0.17±0.064相比

7、差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 2.在伴有和不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中，CXCR7mRNA相對表達的中位數(shù)分別為1.455和0.74，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CXCR7蛋白的相對表達量分別為0.276±0.055和0.2±0.026，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 3.在不同分化程度的腫瘤組織中，CXCR7mRNA和蛋白的表達無顯著性差異(P>0.05)。 4.CXCR7mRNA在人結(jié)腸癌細

8、胞系HT-29中的表達水平高于在SW-480中的表達水平。 結(jié)論 1.CXCR7在人結(jié)腸癌組織中的表達顯著增高，并且在伴有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中表達上調(diào)。 2.在不同分化程度的結(jié)腸癌組織中，CXCR7的表達無差異。 3.HT-29細胞中CXCR7mRNA的表達較高。 第二章構(gòu)建CXCR7shRNA重組慢病毒表達載體 目的 篩選有效的CXCR7siRNA序列，構(gòu)建重組慢病毒CX

9、CR7shRNA表達載體。 方法 1.篩選有效抑制人結(jié)腸癌細胞CXCR7表達的siRNA序列：設(shè)計3個針對CXCR7靶基因序列的siRNA序列，分別構(gòu)建重組shRNA質(zhì)粒，小量包裝shRNA慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細胞HT-29，F(xiàn)Q-PCR和WB方法分別測定轉(zhuǎn)染后HT-29細胞中CXCR7mRNA和蛋白的表達水平，證實沉默效果，篩選出有效靶點。 2.構(gòu)建LV-CXCR7shRNA:用所篩選出的siRNA序列構(gòu)

10、建重組shRNA質(zhì)粒，大量包裝LV-CXCR7shRNA，并檢測病毒滴度。 結(jié)果 1.FQ-PCR檢測3個siRNA序列對CXCR7基因的沉默效應(yīng)，其中以LV-CXCR7shRNA-2下調(diào)最為明顯(72％)，WB檢測結(jié)果與其一致。 2.選擇沉默效應(yīng)為72％的siRNA序列包裝shRNA慢病毒載體，測定病毒滴度為4.Oxl08TU/mL。 結(jié)論 成功構(gòu)建慢病毒CXCR7shRNA表達載體，可有效下調(diào)

11、人結(jié)腸癌HT-29細胞中CXCR7mRNA和蛋白的表達。 第三章靶向抑制CXCR7的表達對人結(jié)腸癌細胞生物學特性的影響 目的 研究靶向抑制CXCR7的表達對人結(jié)腸癌細胞增殖、遷移活性的影響。 方法 1.將人結(jié)腸癌細胞HT-29分為3組：實驗組、陰性對照組和空白對照組，實驗組加入LV-CXCR7shRNA;陰性對照組加入LV-shRNA陰性對照；空白對照組不予任何處理。 2.FQ-PCR和W

12、B方法分別測定各組細胞CXCR7mRNA和蛋白的表達水平 3.細胞活性實驗( MTT)、Transwell細胞遷移實驗檢測各組細胞的增殖和遷移活力。 結(jié)果 1.CXCR7mRNA和蛋白的表達水平：FQ-PCR結(jié)果顯示實驗組CXCR7mRNA的相對表達水平低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)，而兩組對照組之間相比較無顯著性差異(P>0.05)。WB結(jié)果與FQ-PCR一致，提示LV-CXCR7shRNA對HT-

13、29細胞的CXCR7基因沉默有效。 2.細胞活性實驗(MTT)：結(jié)果顯示實驗組細胞生長曲線較平緩，細胞生長速度較陰性對照組和空白對照組顯著降低(P<0.05)；陰性對照組細胞生長曲線較空白對照組低平，提示靶向沉默CXCR7的表達明顯抑制結(jié)腸癌細胞的增殖活性，同時慢病毒載體本身具有的潛在細胞毒性。 3.Transwell細胞遷移實驗：結(jié)果顯示實驗組穿透濾過膜細胞數(shù)量較陰性對照組和空白對照組明顯減少(P<0.05)，兩對照組

14、比較無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果提示靶向抑制CXCR7的表達明顯抑制人結(jié)腸癌細胞HT-29的遷移活性。 結(jié)論 靶向沉默CXCR7的表達抑制結(jié)腸癌細胞增殖和遷移活性 第四章 CXCR7shRNA重組慢病毒表達載體對人結(jié)腸癌荷瘤裸鼠皮下種植瘤的治療作用 目的 探討慢病毒載體介導(dǎo)的CXCR7shRNA對人結(jié)腸癌裸鼠皮下種植瘤生長的抑制作用，為進一步研究以CXCR7為靶點的結(jié)腸癌基因治療奠定基礎(chǔ)。

15、 方法 1.建立人結(jié)腸癌荷瘤鼠模型，計算成瘤率。 2.動物分組：將人結(jié)腸癌荷瘤裸鼠隨機分為3組，每組8只：治療組：瘤體內(nèi)注射LV-CXCR7shRNA50UL;陰性對照組：瘤體內(nèi)注射LV-shRNA negative control50μL;空白對照組：瘤體內(nèi)注射PBS50μL。 3.給藥后各組裸鼠每3天測量荷瘤裸鼠腫瘤體積，繪制瘤體增長曲線。 4.24天后處死動物，取出種植瘤，測量其體積、重量，計

16、算抑瘤率。 5.FQ-PCR和WB方法分別測定腫瘤組織的CXCR7mRNA和CXCR7蛋白表達水平。 結(jié)果 1.人結(jié)腸癌荷瘤鼠模型構(gòu)建成功，成瘤率為100％。 2.與陰性對照組和空白對照組比較，治療組瘤體的增長速度慢、體積小(P<0.05)，重量減輕(P<0.05)，抑瘤率分別為38％和34.04％。 3.治療組的瘤體組織中CXCR7mRNA和蛋白的表達水平低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05