副豬嗜血桿菌hxuCBA基因簇克隆表達(dá)及其免疫特性研究.pdf

1、由副豬嗜血桿菌(Haemophlius parasuis，HPS)引起的Gl(a)sser's病已經(jīng)給全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失。鐵幾乎是所有生物體不可或缺的微量營養(yǎng)元素，它可以作為多種生物過程的電子受體或供體發(fā)揮作用。血紅素是細(xì)菌重要的鐵源之一，由hxuCBA基因簇組成的hxu血紅素?cái)z取系統(tǒng)是副豬嗜血桿菌獲取鐵源的途徑之一。本文通過對(duì)組成該系統(tǒng)的三個(gè)基因進(jìn)行克隆表達(dá)，并分別對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、免疫原性、免疫保護(hù)性、抗血清殺菌等

2、研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.HPS hxuCBA基因簇的克隆、鑒定及分析
　　針對(duì)HPS hxuC、hxuB、hxuA基因（組成hxu血紅素?cái)z取系統(tǒng)的基因）分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物（各基因片段中信號(hào)肽序列已去除），基因片段大小分別為2064bp、1617bp、2847bp。通過PCR的方法從HPS四川M-3分離株的基因組中擴(kuò)增得到hxuC、hxuB、hxuA基因，分別構(gòu)建pMD19-T-C、pMD19-T-B、pMD19-T-

3、A重組克隆質(zhì)粒，三種質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定顯示突變堿基未形成終止密碼子，與HPS SH0165菌株的核苷酸序列一致性分別達(dá)99.22％、99.13％、98.11％, hxuC和hxuB基因序列無堿基缺失，hxuA基因序列有6個(gè)堿基缺失。
　　對(duì)HPS HxuC、HxuB、HxuA氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示HxuC、HxuB、HxuA成熟期蛋白分別由688、539、949個(gè)氨基酸組成，蛋白大小分別為78.07kDa、60.72k

4、Da、105.72kDa，等電點(diǎn)分別為9.23、9.34、6.36，均無跨膜區(qū)存在。三種蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均由無規(guī)則卷曲(30.81％、30.80％、38.78％)、延伸鏈(19.48％、28.76％、29.08％)、α螺旋(40.55％、28.57％、22.13％)和β轉(zhuǎn)角(9.16％、11.87％、10.01％)組成。HxuC和HxuB屬于外膜蛋白，HxuA屬于胞外蛋白。通過功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析，三種蛋白均含有多個(gè)糖基化、磷酸化位點(diǎn)，另外H

5、xuC、HxuB、HxuA分別含有1個(gè)TonB依賴受體蛋白信號(hào)2位點(diǎn)、1個(gè)ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)基序A（P環(huán)）、1個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位序列?？乖砦环治鲲@示HxuC、HxuB、HxuA蛋白均含有多個(gè)抗原決定簇位點(diǎn)，并且分別有30、20、38個(gè)與細(xì)胞毒性T細(xì)胞結(jié)合的抗原表位位點(diǎn)。同時(shí)對(duì)HxuC進(jìn)行同源建模，發(fā)現(xiàn)HxuC蛋白在同種間同源性很高，而在同屬與同科間同源性很低。
　　2.HPS hxuCBA基因簇的表達(dá)及純化
　　利用BamH

6、Ⅰ和NcoⅠ對(duì)pMD19-T-C、pMD19-T-B、pMD19-T-A和pET39b進(jìn)行雙酶切，16℃進(jìn)行連接，構(gòu)建pET39-C、pET39-B、pET39-A重組表達(dá)質(zhì)粒，將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coil(BL21)表達(dá)菌內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。優(yōu)化蛋白表達(dá)條件的結(jié)果顯示，HxuC經(jīng)37℃，0.2 mmol/L IPTG濃度誘導(dǎo)6h達(dá)到最大表達(dá)量，HxuB經(jīng)37℃，1.2mmol/L IPTG濃度誘導(dǎo)3h達(dá)到最大表達(dá)量，HxuA在30℃，I

7、PTG誘導(dǎo)濃度0.8mmol/L誘導(dǎo)2h表達(dá)量最大。經(jīng)SDS-PAGE顯示三種重組蛋白均可以可溶性和包涵體形式存在，分子量大約為105 kDa、87 kDa、130 kDa（含載體部分）。然后通過鎳離子親和層析法純化得到目的蛋白，純化的蛋白經(jīng)透析后進(jìn)行western-blot，結(jié)果表明三種蛋白均具有良好的反應(yīng)原性。
　　3.HPS HxuC、HxuB、HxuA蛋白的免疫特性研究
　　以昆明小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用自制的HxuC、

8、HxuB、HxuA、HxuCBA(包含HxuC、HxuB、HxuA)疫苗和HPS M-3全菌滅活苗進(jìn)行皮下注射免疫。一免后第14天進(jìn)行二免。一免和二免分別用弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑。并分別用佐劑和PBS作為對(duì)照。每次免疫后7天對(duì)小鼠進(jìn)行斷尾收集血清。通過ELISA的方法檢測(cè)抗體水平和細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示小鼠抗HxuC、HxuB、HxuA、HxuCBA、M-3血清的抗體效價(jià)分別達(dá)到1∶6400、1∶3200、1∶1600、1∶128

9、00、1∶12800;相比于免疫前，細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平均有所升高，而且一免和二免結(jié)果呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。
　　本研究進(jìn)行了抗血清殺菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示HxuC、HxuB、HxuA、HxuCBA、M-3、佐劑、PBS組的細(xì)菌存活率分別為28.2％、32.3％、38.6％、35.1％、28.5％、46.9％、48.3％。由此可見，HxuC、HxuB、HxuCBA對(duì)HPS M-3有明顯的抗菌作用，而HxuA的抗菌作用相對(duì)

10、較弱。以昆明小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，測(cè)出HPS M-3菌株的半數(shù)致死量LD50，約為1.3×109cfu。隨后進(jìn)行了攻毒保護(hù)試驗(yàn)，免疫程序同上。另外設(shè)立全菌滅活免疫組。二免后第7天對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔攻毒(5×LD50)，攻毒后統(tǒng)計(jì)小鼠發(fā)病死亡狀況。結(jié)果顯示PBS對(duì)照組和佐劑對(duì)照組小鼠全部死亡，HxuC、HxuB、HxuA、HxuCBA、M-3免疫組保護(hù)率為87.5％、62.5％、37.5％、75.0％、87.5％。另外，這三種蛋白均能減少副豬嗜血