A群輪狀病毒單克隆抗體及免疫膠體金試紙條制備.pdf

1、豬輪狀病毒(Porcinerotavirus，PoRV)屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，是引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原之一。被PoRV感染的仔豬主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐，嚴(yán)重者脫水，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的危害。PoRV存在多種血清型，且各個(gè)血清型之間無(wú)交義保護(hù)或交義保護(hù)性很差。資料顯示，我國(guó)豬群中輪狀病毒的感染以A群為主，在A群PoRV中VP6蛋白是群抗原，在各毒株中高度保守。目前，我國(guó)PoRV的診斷主要還是依賴于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷，其操作過(guò)程復(fù)雜、耗

2、時(shí)，并且需要昂貴的儀器。因此，針對(duì)PoRV敏感性強(qiáng)、特異性高并能應(yīng)用于現(xiàn)地的快速診斷方法的建立是十分必要的。 本試驗(yàn)以A群PoRV代表株OSU毒株(G5型)為免疫原，按常規(guī)方法免疫BALB/c小鼠，利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，制備了8株抗PoRV的單克隆抗體，分別命名為1D5、1B5、1G9、1C7、3C10、1F10、1D11、1F3。ELISA結(jié)果表明，8株單克隆抗體腹水的效價(jià)分別為：1:6400、1:12800、1:25600

3、、1:12800、1:6400、1:6400、1:25600和1:6400。類(lèi)-亞類(lèi)-型鑒定結(jié)果顯示，1D5、185和1C7屬于IgM類(lèi)，1G9、3C10、1F10和1F3屬于IgG2b亞類(lèi)，1D11屬于IgG2a亞類(lèi)，而其輕鏈均為κ鏈。Western-blot結(jié)果表明，1D5、1G9、1C7、1F10和1D11單克隆抗體與PoRVVP6蛋白反應(yīng)，1B5、3C10和1F3單克隆抗體與PoRVVP7蛋白反應(yīng)。疊加ELISA結(jié)果顯示，進(jìn)行抗

4、原表位的初步分析，8株單抗識(shí)別5個(gè)不同的抗原表位，即1D5和1F10單克隆抗體針對(duì)同一表位、1G9單克隆抗體針對(duì)一個(gè)表位、1C7和1D11單克隆抗體針對(duì)同一表位、1B5和1F3單克隆抗體針對(duì)同一表位、3C10單克隆抗體針對(duì)一個(gè)表位，單克隆抗體相對(duì)親和力大小為1B5＞1D11＞1D5(1C7、1F10、1F3)＞1G9＞3C10。 膠體金免疫層析技術(shù)具有快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確直觀等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合單克隆抗體技術(shù)又具有良好的特異性和敏感性，是目前

5、現(xiàn)地應(yīng)用最廣泛的一種診斷方法。本試驗(yàn)利用抗A群PoRVOSU毒株(G5型)VP6蛋白的1G9和1D11單克隆抗體為探針制備了檢測(cè)PoRV的膠體金免疫層析試紙條。利用檸檬酸三鈉還原法分別制備粒徑約為20nm和40nm的膠體金。然后剛均一性好的20nm的膠體金標(biāo)記1G9的單克隆抗體(即單克隆抗體1G9：膠體金=8.57μg:1mL膠體金)，同時(shí)用純化的1D11單克隆抗體(2.4μg/cm)和羊抗鼠IgG二抗(3.2μg/cm)包被M135硝

6、酸纖維素膜分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，與金標(biāo)墊組裝成試紙條。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)制備的膠體金試紙條可以檢出5.4μg/mL純化的PoRVOSU毒株抗原和1.0×103.4TCID50/mL病毒。在特異性試驗(yàn)中，用制備的試紙條對(duì)PoRVOSU毒株(G5型)、PoRVJS毒株(G9型)、牛輪狀病毒NCDV毒株(G6型)、羊輪狀病毒LLR-85毒株(G10型)、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病

7、毒2型和豬偽狂犬病毒進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，PoRVOSU毒株(G5型)、PoRVJS毒株(G9型)、牛輪狀病毒NCDV毒株(G6型)、羊輪狀病毒LLR-85毒株(G10型)為陽(yáng)性，其余均為陰性。在現(xiàn)地試驗(yàn)中，對(duì)我國(guó)部分省市37份仔豬腹瀉的糞便樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，本試驗(yàn)制備的膠體金試紙條與韓國(guó)的PoRV膠體金試紙條的符合率為91.7％(11/37，12/37)。 本研究結(jié)果表明，利用抗A群PoRVOSU毒株(G5型)VP6蛋