腎絡(luò)通對(duì)梗阻性腎病大鼠氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、梗阻性腎病是因尿液排出障礙引發(fā)的腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷的泌尿外科常見(jiàn)疾病，其典型病理改變?yōu)檠仔约?xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞增殖與凋亡、膠原成分異常沉積及腎間質(zhì)纖維化。目前臨床上對(duì)梗阻性腎病的治療主要為解除梗阻，恢復(fù)尿路通暢，但是很多患者在梗阻因素解除后腎功能仍不能恢復(fù)，甚至繼續(xù)惡化，因此，研究梗阻性腎病的發(fā)病機(jī)制可為臨床治療提供理論依據(jù)。最近的研究表明，梗阻性腎病與氧自由基引起的氧化應(yīng)激和腎小管上皮細(xì)胞凋亡有密切聯(lián)系。梗阻造成腎積水繼而腎盂內(nèi)壓力升高，引

2、發(fā)腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變。腎小管血供減少誘發(fā)腎小管上皮細(xì)胞缺血缺氧性壞死和細(xì)胞凋亡，同時(shí)缺氧導(dǎo)致大量氧自由基釋放，進(jìn)一步加重腎小管上皮細(xì)胞的氧化損傷;腎血流量的減少還可導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)率下降和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensin-aldosterone，RAAS)激活，該系統(tǒng)激活后產(chǎn)生大量氧自由基和核因子-κB(Nuclear factor-κ B，NF-κ B)，誘導(dǎo)促凋亡信號(hào)釋放，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)研

3、究證實(shí)應(yīng)用抗氧化藥物可減輕腎臟氧化損傷、抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡，改善腎臟功能，說(shuō)明氧化應(yīng)激可能參與了細(xì)胞凋亡進(jìn)程。此外，梗阻介導(dǎo)的缺血性氧化損傷誘發(fā)腎小管上皮細(xì)胞凋亡可能與多種促凋亡通路密切相關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)針對(duì)UUO(Unilateral ureteral obstruction單側(cè)輸尿管結(jié)扎)模型中氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡可能相關(guān)機(jī)制，給予特異性抗氧化劑Tempol治療，同時(shí)給予化瘀通絡(luò)方腎絡(luò)通，觀察MDA、8-OhdG、8-iso-PGF2

4、α等氧化損傷指標(biāo)及Caspase-12、caspase-9、Bcl-2、Bax等凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，初步探討中藥對(duì)梗阻性腎病大鼠氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及作用機(jī)制。
　　第一部分腎絡(luò)通對(duì)梗阻性腎病大鼠氧化損傷和腎臟組織病理形態(tài)學(xué)的影響
　　方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水，溫度條件控制在（22±2）℃。適應(yīng)性飼養(yǎng)1WK后，48只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham group）、UUO組(UUO group)、Temp

5、ol組(Tempol group)、腎絡(luò)通組(SLT group)，每組12只。各組大鼠10％水合氯醛注射后，于左側(cè)中腹部切開(kāi)皮膚，游離左側(cè)輸尿管，分別在輸尿管上1/3處和中1/3處用絲線結(jié)扎，切斷輸尿管，逐層縫合皮膚。假手術(shù)組僅將輸尿管游離但不結(jié)扎離斷。術(shù)后第10天腎臟明顯腫大，輸尿管擴(kuò)張，腎盂明顯積水，模型復(fù)制成功。術(shù)后開(kāi)始給藥，Tempol組以Tempol30 mg/(kg·d)入水瓶（避光）自由飲用;腎絡(luò)通組給予腎絡(luò)通煎劑26

6、g/(kg·d)入水瓶飲用，假手術(shù)組及UUO組給予等容量生理鹽水飲用，均每天1次。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物入代謝籠收集尿液，備檢。連續(xù)干預(yù)10天。10天后，各組大鼠稱重后斷頭處死，留取血液標(biāo)本，備檢;切取梗阻側(cè)腎臟，除去被膜后稱重，部分腎組織置于4％多聚甲醛固定，行HE、Masson染色。
　　采用SPSS13.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA

7、檢驗(yàn)，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。所有假設(shè)檢驗(yàn)方法均以0.05和0.01為顯著性水平標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1、各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)改變
　　HE染色顯示，假手術(shù)組有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊;UUO組腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管明顯擴(kuò)張，上皮細(xì)胞變性、濁腫、壞死、脫落;Tempol組及腎絡(luò)通組亦可見(jiàn)腎小管擴(kuò)張及上皮細(xì)胞變性壞死等，但炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。Masson染色顯示，假手術(shù)組可見(jiàn)少量膠原成

8、分表達(dá)，主要位于腎小球/腎小管基底膜及腎間質(zhì);UUO組腎臟結(jié)構(gòu)紊亂，膠原成分顯著增多，以腎間質(zhì)為主;Tempol組及腎絡(luò)通組膠原纖維表達(dá)較假手術(shù)組增多，但與UUO組相比則明顯減少。PAS染色顯示，UUO組腎小球基底膜明顯增厚，腎小球內(nèi)糖原沉積增多，腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管部分萎縮，管腔閉塞或擴(kuò)張，腎間質(zhì)變寬。假手術(shù)組無(wú)上述改變，Tempol組及腎絡(luò)通組腎小球糖原沉積減少，可見(jiàn)或多或少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球基底膜輕度增厚，腎小管擴(kuò)張，

9、但較UUO組減輕。
　　2、各組大鼠血清MDA和血清、尿液8-OhdG及8-iso-PGF2α水平比較
　　與假手術(shù)組比較，UUO組血清MDA和血清、尿液8-OHdG含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05);與UUO組比較，Tempol組及腎絡(luò)通組血清MDA和血清、尿液8-OhdG含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)。
　　與假手術(shù)組比較，UUO組尿液8-iso-PGF2α含量

10、明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;與UUO組比較，Tempol組及腎絡(luò)通組尿液8-iso-PGF2α含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與假手術(shù)組比較，UUO組血清8-iso-PGF2α含量有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與UUO組比較，Tempol組及腎絡(luò)通組尿液8-iso-PGF2α含量有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　第二部分腎絡(luò)通對(duì)梗阻性腎病大鼠細(xì)胞凋亡的影響
　

11、　方法:動(dòng)物分組、模型復(fù)制、給藥方法同第一部分，共10天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取腎臟標(biāo)本，部分腎組織置于4％多聚甲醛固定，用于光鏡和TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同第一部分。
　　結(jié)果:
　　1、光鏡觀察腎臟細(xì)胞凋亡
　　1000倍油鏡下可觀察到UUO組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核染成紫藍(lán)色，細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為核濃縮、核裂解。
　　2、TUNEL法檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡
　　假手術(shù)組可見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞，UUO組陽(yáng)性

12、凋亡細(xì)胞顯著增多(P＜0.01);與UUO組比較，Tempol組及腎絡(luò)通組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05），其中Tempol組下降稍明顯，但與腎絡(luò)通組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第三部分腎絡(luò)通對(duì)梗阻性腎病大鼠細(xì)胞凋亡Caspase通路的影響
　　方法:動(dòng)物分組、模型復(fù)制、給藥方法同第一部分，共10天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)切取梗阻側(cè)腎臟，部分腎組織4％多聚甲醛固定用于免疫組化，部分腎組織-70℃保存用于提取蛋白。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同第一部分。

13、r>　　結(jié)果:
　　1、免疫組化檢測(cè)Caspase12、Caspase9的表達(dá)
　　假手術(shù)組caspase12呈弱表達(dá);UUO組表達(dá)明顯增強(qiáng)，其中以髓質(zhì)擴(kuò)張的腎小管上皮細(xì)胞胞漿表達(dá)最為顯著;Tempol組及腎絡(luò)通組亦可見(jiàn)到陽(yáng)性表達(dá)，呈局部中度表達(dá)，但較UUO組明顯減弱。
　　假手術(shù)組caspase9呈弱表達(dá)，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿;UUO組表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿，部分附著于細(xì)胞膜，呈棕黃色或棕

14、褐色顆粒;Tempol組及腎絡(luò)通組亦可見(jiàn)Caspase9陽(yáng)性表達(dá)，較假手術(shù)組為甚，但與UUO組比較則明顯減輕。
　　2、Western Blot檢測(cè)Caspase12、Caspase9蛋白表達(dá)
　　與假手術(shù)組比較，UUO組caspase12，caspase9蛋白表達(dá)明顯上調(diào);與UUO組比較，Tempol組及腎絡(luò)通組其表達(dá)均被下調(diào);與Tempol組相比，腎絡(luò)通組caspase9未見(jiàn)明顯差異，但caspase12有顯著性差異。<

15、br>　　第四部分腎絡(luò)通對(duì)梗阻性腎病大鼠細(xì)胞凋亡因子Bcl-2、BaX表達(dá)的影響
　　方法:動(dòng)物分組、模型復(fù)制、給藥方法同第一部分，共10天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)切取梗阻側(cè)腎臟，部分腎組織4％多聚甲醛固定用于免疫組化，部分腎組織-70℃保存用于提取mRNA及蛋白。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同第一部分。
　　結(jié)果:
　　1、Real-time PCR檢測(cè)Bcl-2、Bax及Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)
　　與假手術(shù)組比較，UUO組中Ba

16、x及Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)上調(diào)，Bcl-2mRNA表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與UUO組比較，Tempol組及腎絡(luò)通組Bax及Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，而B(niǎo)cl-2 mRNA表達(dá)上調(diào)，其中以Tempol組作用更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2、免疫組化檢測(cè)腎組織Bcl-2、Bax表達(dá)
　　假手術(shù)組可見(jiàn)Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)，主要表達(dá)于腎小管和皮髓交界處，腎間質(zhì)也可見(jiàn)少量

17、表達(dá)，呈棕黃色或棕褐色顆粒;UUO組其表達(dá)明顯下降，主要表達(dá)于近曲小管;與UUO組比較，Tempol組及腎絡(luò)通組Bcl-2表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　假手術(shù)組可見(jiàn)Bax陽(yáng)性表達(dá)，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿，呈棕黃色或棕褐色顆粒;與假手術(shù)組比較，UUO組其表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿;與UUO組比較，Tempol組及腎絡(luò)通組Bax表達(dá)明顯下降。
　　3、Western Blot檢測(cè)腎組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

18、>　　與假手術(shù)組比較，UUO組大鼠Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與UUO組比較，Tempol組及腎絡(luò)通組大鼠Bax表達(dá)顯著下調(diào)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)上調(diào)，其中以Tempol組作用更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎復(fù)制梗阻性腎病腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型，腎臟病理顯示大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、輸尿管擴(kuò)張明顯及膠原成分大量沉積。腎絡(luò)通可改善UU

19、O大鼠腎組織間質(zhì)纖維化病理?yè)p傷程度。
　　2、腎絡(luò)通可下調(diào)MDA、8-OhdG、8-iso-PGF2α等氧化損傷指標(biāo)的表達(dá)，改善UUO大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)，起到一定的抗氧化損傷的作用。
　　3、腎絡(luò)通可以通過(guò)抑制腎臟固有細(xì)胞過(guò)度凋亡，維持細(xì)胞凋亡和增殖之間的動(dòng)態(tài)平衡，從而減輕UUO誘導(dǎo)的腎臟損傷，起到腎臟保護(hù)作用。
　　4、氧化應(yīng)激通過(guò)激活Caspase家族上游效應(yīng)介質(zhì)Caspase-12及Caspase-9實(shí)現(xiàn)凋亡信號(hào)的

20、啟動(dòng)和傳導(dǎo)。腎絡(luò)通可以通過(guò)下調(diào)Caspase-12、Caspase-9蛋白表達(dá)來(lái)抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。
　　5、Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中Bcl-2為抑制凋亡因子，Bax為促進(jìn)凋亡因子，兩者共同調(diào)控細(xì)胞存亡。腎絡(luò)通可以通過(guò)上調(diào)Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax mRNA蛋白表達(dá)，且下調(diào)Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)，減少輸尿管梗阻后腎小管上皮細(xì)胞凋亡，起到腎臟保護(hù)作用