普魯蘭多糖高產(chǎn)菌株Y68多糖發(fā)酵生產(chǎn)及其機(jī)理初步研究.pdf

1、普魯蘭多糖(pullulan)是一種應(yīng)用價(jià)值較高的微生物胞外多糖，除了普魯蘭多糖本身在農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)、制藥工業(yè)和化妝品工業(yè)中具有重要用途外，經(jīng)過(guò)化學(xué)改造的各種普魯蘭衍生物還是很重要的抗病毒、抗血栓、抗血凝固、抗腫瘤藥物的工業(yè)原料。但由于現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)菌株產(chǎn)量低，實(shí)際應(yīng)用就受到了很大的限制。根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)有的普魯蘭生產(chǎn)菌株主要是普魯蘭類(lèi)酵母(Aureobasidium pullulans)，其產(chǎn)量一般在3.0％-5.0％(w/v)

2、左右，并且現(xiàn)已報(bào)導(dǎo)的產(chǎn)普魯蘭菌株發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖時(shí)容易產(chǎn)生色素，給產(chǎn)品的后處理帶來(lái)極大的不便，隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行，發(fā)酵液的pH不斷下降，從而影響了胞外多糖的產(chǎn)生。因此，獲得具有新特征和產(chǎn)量更高的普魯蘭生產(chǎn)菌株和研究這些菌株發(fā)酵最佳條件的工作就變得非常重要。 目前有關(guān)A.pullulans產(chǎn)普魯蘭多糖的機(jī)理還了解很少，與普魯蘭合成相關(guān)的酶也鮮有報(bào)導(dǎo)。本研究主要利用生物化學(xué)方法測(cè)定了不同胞外多糖產(chǎn)量細(xì)胞中UDP-葡萄糖庫(kù)的大小，有關(guān)

3、的酶活性大小，以便了解UDP-葡萄糖庫(kù)在真核微生物調(diào)節(jié)過(guò)量合成胞外普魯蘭中的作用，為進(jìn)一步提高真核微生物胞外多糖的產(chǎn)量提供理論依據(jù)。這必將對(duì)普魯蘭多糖的工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的意義。 本實(shí)驗(yàn)室保存的菌種Y68在250mL搖瓶中發(fā)酵培養(yǎng)56h普魯蘭多糖產(chǎn)量可達(dá)52.47g/L。針對(duì)此菌株在發(fā)酵時(shí)的營(yíng)養(yǎng)、初始pH、通氣量和轉(zhuǎn)速等條件的需求，我們?cè)?L發(fā)酵罐中進(jìn)行了發(fā)酵條件的研究，發(fā)現(xiàn)菌株Y68發(fā)酵產(chǎn)普魯蘭的最適條件為：葡萄糖碳源，初始p

4、H7.0，最佳轉(zhuǎn)速300rpm，最佳通氣量為6.5L/min。在此條件下，得到的普魯蘭最高產(chǎn)量為65 g/L。菌株Y68是目前所有酵母中普魯蘭產(chǎn)量最高的菌株。恒定pH對(duì)該菌株胞外普魯蘭多糖的生產(chǎn)同樣有影響，最適生產(chǎn)恒定pH為6.0，但產(chǎn)量低于其在pH 7.0情況下的產(chǎn)量。在后面的研究中發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)幾種酶活力的差異可以解釋該現(xiàn)象。經(jīng)微生物常規(guī)方法鑒定以及分子生物學(xué)方法18S rDNA、ITS序列的克隆測(cè)序證實(shí)：Y68菌株應(yīng)屬Aureobas

5、idium.pullulans。 為了確定胞外普魯蘭產(chǎn)量與胞內(nèi)各酶活力水平間的關(guān)系，本文研究了不同培養(yǎng)條件、產(chǎn)不同量普魯蘭多糖情況下Y68菌株細(xì)胞中UDPG含量的變化以及在不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞中普魯蘭多糖合成酶、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、UDPG焦磷酸化酶以及磷酸葡萄糖變位酶活力的差異。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1.研究Y68菌株在不同培養(yǎng)條件下(包括不同的pH、不同的碳源)和不同菌株在相同培養(yǎng)條件下胞外多糖產(chǎn)量以及其與細(xì)胞內(nèi)UDPG含量的關(guān)

6、系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：胞外普魯蘭多糖產(chǎn)量與細(xì)胞內(nèi)UDPG含量成反比例關(guān)系，即胞外多糖量高的情況下胞內(nèi)的UDPG含量反而低。反之多糖量高的情況下，胞內(nèi)的15DPG含量反而較高。這一結(jié)果與乳酸菌中的情況恰好相反。 2.Y68菌株在不同碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)普魯蘭合成酶、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、UDPG焦磷酸化酶以及磷酸葡萄糖變位酶的酶活力都隨胞外多糖產(chǎn)量的增加而升高，表明這些酶對(duì)胞外多糖生產(chǎn)有促進(jìn)作用。Y68菌株在不同pH條件培養(yǎng)80小時(shí)結(jié)果發(fā)現(xiàn)

7、，細(xì)胞中除普魯蘭合成酶活力有一個(gè)先升高后降低的過(guò)程外，其它酶都是逐漸升高后趨于穩(wěn)定。總體看來(lái)這些胞內(nèi)酶都對(duì)胞外普魯蘭多糖的累積有明顯的促進(jìn)作用。 本研究純化的Y68菌株細(xì)胞內(nèi)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，其N(xiāo)ative-PAGE表觀分子量為350 kDa，而SDS-PAGE表觀分子量為50.8 kDa。該酶的最適作用pH、溫度分別為6.0、和40℃。化合物二硫蘇糖醇(DTT)對(duì)酶有保護(hù)作用，而EDTA、碘乙酸和PMSF則對(duì)酶有明顯的抑制作用。