重陽木叢枝病植原體的分子鑒定及與其它幾種植原體的相關(guān)性研究.pdf

1、重陽木是我國南方重要的闊葉樹種之一，叢枝病在我國重陽木栽種區(qū)發(fā)生普遍，表現(xiàn)為植株葉片變小、黃化或變紅、枝條節(jié)問縮短、側(cè)芽過度生長，導致叢枝、衰退、梢枯，嚴重時整株枯死。已有研究表明重陽木叢枝病(BiWB)是由植原體(原稱為類菌原體)引起的，目前此病害僅在我國有報道。由于病原分子生物學研究信息缺乏而未能被鑒定和系統(tǒng)歸類。本研究用分子生物學方法對我國不同地區(qū)BiWB植原體進行鑒定，并運用新的分類方法對其進行了分類。擴增、克隆并測定了該植原體

2、的浙江、安徽和江西分離物16S rRNA基因、23S rRNA基因、延伸因子(tuf)基因、核糖體蛋白(rp)基因及16S-23SrDNA間區(qū)(SR)等相對保守序列，將得到的序列與GenBank上已公布的植原體相應(yīng)基因的序列進行比較，最終確定了三個地區(qū)的BiWB由單一病原侵染所致，未發(fā)現(xiàn)與其它組植原體混合感染的現(xiàn)象。結(jié)果顯示，BiWB植原體與榆樹黃化組(Elm yellows group，16SrⅤ)成員的16S rDNA序列相似性都在

3、98％以上，而與其它組成員相似性低于97.5％；與棗瘋病(JWB)植原體的SR序列相似性在99％以上；與已測定的絲瓜叢枝病植原體(16SrⅧ)的23S rDNA序列相似性最高，為94％；與河南JWB植原體tuf基因的序列相似性達99.9％；rp基因與16SrⅤ組其中另外三個成員的相似性都在95％以上。從而確定三個地區(qū)BiWB植原體歸屬于榆樹黃化組，與我國發(fā)生JWB、櫻桃致死性黃化和黃槐叢枝病的植原體為同一組的成員，未檢測到過去根據(jù)PCR

4、-RFLP分析結(jié)果鑒定出的三葉草簇生組(Clover proliferation group，16SrⅥ)植原體的存在。 針對重陽木植株中可能存在的對PCR有影響的物質(zhì)，及此植原體基因組與泡桐叢枝病(PaWB)植原體等16SrI成員差異明顯的特點，本研究對DNA提取方法和PCR的條件進行了一系列的摸索和改進，建立了優(yōu)化的實驗條件，包括在DNA提取過程中去掉葉肉、選用組培病苗等，進行PCR時對模板DNA稀釋、選擇最佳退火溫度等。并

5、且發(fā)現(xiàn)不同組植原體間、不同基因間的G+C含量與比率有明顯的差異，這種差異可能會影響PCR擴增的條件。 進一步用BiWB植原體與我國發(fā)生：PaWB、JWB、長春花綠變病(PV)、苦楝叢枝病(CBWB)的重要植原體進行了部分DNA比較，包括23S rRNA基因的序列分析與RFLP、染色質(zhì)外DNA的擴增與產(chǎn)物的RFLP分析、Southem bloting以及幾個地區(qū)PaWB植原體的變異分析。結(jié)果驗證了BiWB植原體作為16SrⅤ組成員

6、的地位；進一步肯定了PV植原體和CBWB植原體被劃為16SrI組成員是恰當?shù)?。所鑒定的與葉酸合成相關(guān)的基因folP在PaWB、BiWB、PV和CBWB植原體中編碼FolP蛋白，未發(fā)現(xiàn)三葉草簇生植原體等的葉酸合成功能喪失的假基因ψfolP，四者的序列相似性都在98％以上。 本研究對BiWB植原體進行了分子鑒定，初步研究了它與其它植原體的系統(tǒng)進化關(guān)系和分子差異；建立了BiWB植原體快速準確的檢測、鑒定與鑒別的技術(shù)體系；為這些植原體的