泡桐叢枝植原體致病相關(guān)基因分子特征及其編碼蛋白功能研究.pdf

1、泡桐(Paulownia sp.)是我國(guó)重要的闊葉樹種之一，泡桐叢枝病(Paulownia witches'broom disease)在我國(guó)發(fā)生普遍，是由泡桐叢枝植原體(Paulownia witches' broomphytoplasma)引起的侵染性病害，表現(xiàn)為腋芽和不定芽大量萌發(fā)至簇生成團(tuán)，有些病樹上會(huì)出現(xiàn)花變?nèi)~癥狀，常常不能正常開花結(jié)實(shí)。為了深入了解植原體致病機(jī)理，本文通過植原體致病相關(guān)基因的克隆、原核表達(dá)、抗血清制備、蛋白活

2、性測(cè)定、瞬時(shí)表達(dá)與病癥分析等方法，對(duì)植原體致病基因的功能進(jìn)行研究和分析，發(fā)現(xiàn)tRNA-ipt基因可能影響了植物細(xì)胞的分裂和增長(zhǎng)，這為植原體致病分子機(jī)制提供了新的思路和線索。
　　 本研究用PCR方法在我國(guó)四種16SrI組植原體中克隆到tRNA異戊烯基焦磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(tRNA-ipt)，并對(duì)其全長(zhǎng)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)泡桐叢枝(Paulowniawitches' broom，PaWB)、桑萎縮（Mulberry dwarf

3、，MD）、長(zhǎng)春花綠變(periwinkle virescence，PeV)及苦楝叢枝（Chinaberry witches' broom，CWB）植原體的tRNA-ipt基因的開放讀碼框長(zhǎng)度均為876bp，G+C含量分別為30％、29.5％、29.5％和29.3％;它們均編碼291個(gè)氨基酸的蛋白，預(yù)測(cè)分子量均為33kDa。四種植原體的IPT蛋白N端皆含有ATP/GTP結(jié)合相關(guān)序列(GPTASGKT)。預(yù)測(cè)該蛋白無跨膜區(qū)，分布在細(xì)胞質(zhì)中。

4、四種植原體的tRNA-IPT之間的氨基酸序列相似性為99.1％-99.5％，與同組植原體蛋白相似性為95.4％-99.3％，與其他組植原體低于70％;系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，所有已知9個(gè)植原體tRNA-IPT共聚為一大支，且與無膽甾原體遺傳關(guān)系更近。
　　 對(duì)泡桐叢枝植原體tRNA-ipt基因進(jìn)行原核表達(dá)并制備抗體。利用Western blot和FITC間接免疫熒光顯微鏡檢測(cè)其在植原體中的表達(dá)。使用分光光度計(jì)分析該基因?qū)Υ竽c桿菌生長(zhǎng)的

5、影響，用ELISA測(cè)定轉(zhuǎn)化菌株細(xì)胞分裂素含量。SDS-PAGE結(jié)果顯示tRNA-IPT蛋白在大腸桿菌中得到表達(dá)。首次獲得泡桐叢枝植原體tRNA-IPT抗體并檢測(cè)到該蛋白在泡桐發(fā)病組織中的特異表達(dá)。經(jīng)過對(duì)轉(zhuǎn)化菌株生長(zhǎng)曲線及玉米素含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該基因能促進(jìn)大腸桿菌后期生長(zhǎng)和玉米素核苷的積累。結(jié)果表明泡桐叢枝植原體tRNA-IPT蛋白能夠在植原體中表達(dá)，根據(jù)該基因?qū)Ξ愒淳晟L(zhǎng)速率和激素合成的影響推斷該蛋白可能參與植原體的細(xì)胞分裂素合成，并

6、在致病過程中起到重要作用。
　　 構(gòu)建病毒表達(dá)載體pCAPE-ipt，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，注射浸潤(rùn)健康泡桐組培苗葉片，使植物細(xì)胞表達(dá)tRNA-IPT蛋白。結(jié)果顯示感染pCAPE-ipt的泡桐離體葉片可以保持較長(zhǎng)的生長(zhǎng)和存活時(shí)間;感染pCAPE-ipt的泡桐植株，兩周后開始長(zhǎng)出腋芽，與泡桐叢枝病早期癥狀極為相似。同時(shí)Western blot證實(shí)tRNA-IPT已在植物中表達(dá)。根據(jù)此結(jié)果推測(cè)，tRNA-IPT蛋白可能影響寄主植物激素平衡，從

7、而導(dǎo)致叢枝病，這為植原體致病分子機(jī)制提供了新的線索。
　　 根據(jù)已發(fā)表植原體質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)兩次PCR擴(kuò)增，獲得大小不同的兩段DNA片段，測(cè)序后拼接得到了4種完整的環(huán)狀質(zhì)粒，分別是桑樹萎縮植原體濮陽(yáng)株系質(zhì)粒(pMDPy)、長(zhǎng)春花綠變植原體海南株系質(zhì)粒(pPeVHn)、泡桐叢枝植原體山東株系質(zhì)粒(pPaWBG33D)及苦楝叢枝植原體福清株系質(zhì)粒(pCWBFq-2)，其中pMDPy為首次測(cè)定，其質(zhì)粒全長(zhǎng)分別為3833bp、394

8、3bp、3843bp和3913bp，4種質(zhì)粒皆編碼5個(gè)蛋白，ORF1和ORF5分別編碼復(fù)制相關(guān)蛋白(RepA)和單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)，ORF2-4編碼未知功能蛋白。4種質(zhì)粒序列的非編碼區(qū)分析表明，ORF1和ORF2之間的非編碼區(qū)存在啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。將4種植原體質(zhì)粒全序列與GenBank中登錄的植原體質(zhì)粒進(jìn)行序列相似性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明這4種質(zhì)粒與其它16SrI組的質(zhì)粒聚為一個(gè)大的分支，與16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育

9、樹基本一致。此研究為進(jìn)一步深入了解不同植原體質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能、寄主?；院唾|(zhì)粒基因變異及進(jìn)化奠定了基礎(chǔ)，也為基于多基因分類鑒定提供新的理論依據(jù)。
　　 本研究首次在泡桐叢枝植原體中獲得胸苷酸激酶基因(tmk)，并在4個(gè)地區(qū)不同品種感病泡桐中檢測(cè)到不同tmk基因。以PaWB-G33D、PaWB-JAN、PaWB-PS和PaWB-BJ株系侵染的泡桐總DNA為模板，擴(kuò)增并克隆了tmk基因。分別由591、600、639和588個(gè)核苷酸組