玻璃化冷凍對人體外成熟卵母細胞微絲分布及發(fā)育潛能的影響.pdf

1、隨著輔助生殖技術(shù)的廣泛開展，卵母細胞的冷凍保存技術(shù)越來越受到關(guān)注，玻璃化冷凍成為卵母細胞冷凍保存的主要技術(shù)之一。而經(jīng)過冷凍復(fù)蘇后如何獲得更高的移植率和臨床受精率成為許多生殖中心關(guān)注的焦點。玻璃化冷凍的損傷尤其是對超微結(jié)構(gòu)的冷凍損傷成為各實驗室研究的重點，它也成為卵母細胞冷凍成敗的關(guān)鍵。近年來，許多科研中心相繼研究了玻璃化冷凍對動物卵母細胞超微結(jié)構(gòu)的冷凍損傷如微管、紡錘體結(jié)構(gòu)和發(fā)育潛能、皮質(zhì)顆粒、線粒體、胞內(nèi)膜電位等。而關(guān)于人類卵母細胞超

2、微結(jié)構(gòu)的實驗研究相對缺乏。鑒于此，本研究主要討論了玻璃化冷凍對體外成熟卵母細胞超微結(jié)構(gòu)—微絲的影響，對比分析了冷凍前后卵母細胞微絲分布的變化;同時按照冷凍后不同的復(fù)蘇時間對各組卵母細胞微絲形態(tài)的恢復(fù)情況進行了比較分析，選出最佳的復(fù)蘇時間并在最佳時間內(nèi)對玻璃化冷凍前后的卵母細胞行胞漿內(nèi)單精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，進一步分析了玻璃化冷凍對人體外成熟卵母細胞發(fā)育潛能的影響。

3、　　第一部分玻璃化冷凍對人體外成熟卵母細胞微絲分布的影響
　　[目的]通過對體外成熟卵母細胞玻璃化冷凍后不同復(fù)蘇時間和新鮮卵母細胞的染色分析，發(fā)現(xiàn)冷凍對微絲分布的影響及復(fù)蘇的最佳時間。
　　[方法]收集未成熟卵母細胞(GV/MⅠ)，經(jīng)過體外培養(yǎng)為成熟卵母細胞，隨機分為新鮮組和玻璃化冷凍組，玻璃化冷凍組按不同的復(fù)蘇時間再次隨機分為復(fù)蘇后1h，2h，3h，4h組。所有卵母細胞用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽行微絲染色，之后用激光共聚焦顯微

4、鏡(LSM780)觀察。
　　[結(jié)果]經(jīng)過冷凍復(fù)蘇后卵母細胞成活率為87.37％。新鮮組卵母細胞微絲分布的正常率為71.11％，復(fù)蘇1h、2h、3h、4h后卵母細胞微絲分布正常率分別為34.15％、44.18％、69.05％、65.79％。與新鮮組相比，復(fù)蘇后1h、2h均具有顯著性差異(P＜0.01，P=0.02)，復(fù)蘇后3h、4h均無顯著性差異（P=1.00，P=0.64），1h、2h之間與3h、4h之間相比均無顯著性差異(P=

5、0.35，P=0.81)。
　　[結(jié)論]玻璃化冷凍復(fù)蘇過程改變了人體外成熟卵母細胞的微絲分布，但是經(jīng)過恰當?shù)膹?fù)蘇時間后微絲分布可恢復(fù)至新鮮狀態(tài)，繼續(xù)增加復(fù)蘇時間并不會增加卵母細胞微絲分布的正常率。說明合適的冷凍復(fù)蘇（約3h以上）并未改變體外成熟卵母細胞的微絲分布。
　　第二部分玻璃化冷凍對人體外成熟卵母細胞發(fā)育潛能的影響
　　[目的]通過對比分析體外成熟卵母細胞玻璃化冷凍前后發(fā)育潛能的變化，結(jié)合第一部分擬從超微結(jié)構(gòu)方面

6、尋找玻璃化冷凍對人體外成熟卵母細胞發(fā)育潛能影響的細胞學(xué)機制。
　　[方法]收集人未成熟(GV/MⅠ)卵母細胞，經(jīng)體外成熟為MⅡ期卵母細胞。將獲得的MⅡ期卵母細胞按隨機化原則分組，分為新鮮組和玻璃化冷凍組。將所有卵母細胞均行卵母細胞漿內(nèi)單精子注射，觀察體外成熟卵母細胞的受精數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)胚數(shù)及囊胚形成數(shù)。
　　[結(jié)果]新鮮組2PN率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚率、優(yōu)質(zhì)囊胚率分別為73.08％、23.08％、19.23％、6.73％，玻璃