印跡基因TSSC3在骨肉瘤干細(xì)胞中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是常見(jiàn)的骨的惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，其發(fā)病率占惡性骨腫瘤總數(shù)的20%，占兒童腫瘤總數(shù)的5%。骨肉瘤惡性程度高，早期即可發(fā)生廣泛的肺轉(zhuǎn)移，約20%的骨肉瘤患者發(fā)生可被影像學(xué)方法檢測(cè)的肺轉(zhuǎn)移，而80%的骨肉瘤患者在單純手術(shù)切除后發(fā)生轉(zhuǎn)移。肺轉(zhuǎn)移引起的呼吸衰竭是導(dǎo)致骨肉瘤死亡的常見(jiàn)原因。研究發(fā)現(xiàn)許多致病因素如化學(xué)因素、放射性物質(zhì)、病毒感染等均能誘導(dǎo)骨肉瘤的發(fā)生。同時(shí)在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，伴隨著一系列

2、的基因和表觀遺傳學(xué)的改變，但這一系列的改變不具有一致性。因而目前的觀點(diǎn)認(rèn)為，骨肉瘤的發(fā)生是一個(gè)多階段演進(jìn)和多基因參與的過(guò)程，但確切的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。隨著腫瘤病因?qū)W研究的深入，發(fā)現(xiàn)腫瘤不僅是一種遺傳有關(guān)的疾病，同時(shí)也是一種表遺傳性疾病，幾乎所有的腫瘤中都有表觀遺傳的異常。其中印跡基因作為一種表遺傳學(xué)機(jī)制，以原癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生及演進(jìn)，備受關(guān)注。
　　 近年來(lái)，隨著干細(xì)胞研究的不斷深入以及腫瘤干細(xì)胞理論的提出，越來(lái)越多

3、的證據(jù)顯示腫瘤是由其內(nèi)部的一小部分細(xì)胞所始動(dòng)和維持的，這一小部分細(xì)胞被稱作腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)。和普通腫瘤細(xì)胞相比，腫瘤干細(xì)胞不僅具有自我更新和多向分化潛能，同時(shí)還具有誘導(dǎo)腫瘤形成的能力。自1994年Lapidot在白血病細(xì)胞中通過(guò)特異性細(xì)胞表面標(biāo)志分離出具有自我更新和維持其惡性能力的急性粒細(xì)胞性白血病干細(xì)胞以來(lái)，研究者們陸續(xù)從腦腫瘤、乳腺癌、消化道腫瘤、惡性黑色素瘤、肺癌、前列腺癌等分離得到了腫瘤

4、干細(xì)胞。
　　 在間葉性腫瘤中，Gibbs等報(bào)道在骨肉瘤中存在一小部分具有自我更新能力，并能在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)條件下形成腫瘤細(xì)胞球的細(xì)胞，這部分細(xì)胞高表達(dá)STAT3和多潛能干細(xì)胞標(biāo)記Oct3/4、Nanog，從而顯示出干細(xì)胞樣的特性。該研究將腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)擴(kuò)展到了間葉來(lái)源的腫瘤，證實(shí)了肉瘤中腫瘤干細(xì)胞的存在。隨后陸續(xù)有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室以不同的方法證實(shí)了骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞的存在。骨肉瘤干細(xì)胞為治愈骨肉瘤提供了可能，但也帶來(lái)了一系列難題，由于

5、骨肉瘤干細(xì)胞的放化療抵抗和高轉(zhuǎn)移特性，使得目前的治療手段都不能根治腫瘤。尋找可行的治療手段是目前面臨的關(guān)鍵問(wèn)題。
　　 我們課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)印跡基因TSSC3(tumor-suppressing STF cDNA3)與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及抗失巢凋亡能力有關(guān)。TSSC3基因，又名IPL基因(imprinted inplacenta and liver)，定位于染色體11p15的胚胎腫瘤抑制區(qū)，屬PHLDA基因超家族，呈母系等位

6、基因表達(dá)，與TDAG51(T cell death associated gene51)高度同源，并含有與凋亡相關(guān)的PQ蛋白基序，推測(cè)TSSC3印跡基因在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞系SaOS2中TSSC3基因啟動(dòng)子區(qū)CG位點(diǎn)的平均甲基化率高，用去甲基化藥物處理該細(xì)胞后TSSC3表達(dá)明顯增高，且細(xì)胞凋亡率也顯著增加。利用載體穩(wěn)定高表達(dá)TSSC3，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)TSSC3在體外能抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，在體內(nèi)能抑制腫瘤生長(zhǎng)，并通

7、過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。但TSSC3在作為腫瘤起始細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞中的作用尚待研究。為了研究TSSC3在骨肉瘤干細(xì)胞中的作用及可能的分子機(jī)制，我們擬首先利用不同方法從MG63、SaOS2和惡性轉(zhuǎn)化的人成骨細(xì)胞hFOB1.19(MThFOB1.19)中分離鑒定出腫瘤干細(xì)胞，并檢測(cè)印跡基因TSSC3在干細(xì)胞中的表達(dá)，然后利用不同載體上調(diào)或下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中TSSC3的表達(dá)，最后檢測(cè)差異表達(dá)TSSC3對(duì)

8、骨肉瘤干細(xì)胞干性和凋亡的影響及其作用機(jī)制。
　　 有鑒于此，本研究分三部分進(jìn)行：
　　 第一部分?jǐn)M通過(guò)腫瘤干細(xì)胞成球培養(yǎng)和基于骨肉瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記(CD133、CD117、Stro-1)的流式細(xì)胞儀分選方法從MG63、SaOS2和惡性轉(zhuǎn)化的人成骨細(xì)胞hFOB1.19(MThFOB1.19)中分離鑒定骨肉瘤干細(xì)胞。并根據(jù)MThFOB1.19細(xì)胞的高克隆形成特性，利用連續(xù)克隆形成和成瘤實(shí)驗(yàn)從該細(xì)胞中分離出腫瘤干細(xì)胞，并對(duì)其自

9、我更新、多向分化和誘導(dǎo)腫瘤形成的能力進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)免疫熒光、RT-PCR等技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)干性相關(guān)因子的表達(dá)。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞模型。
　　 第二部分?jǐn)M采用RT-PCR、western-blot、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)手段檢測(cè)不同方法所獲得的骨肉瘤干細(xì)胞中TSSC3的表達(dá)。采用RU486可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定上調(diào)MThFOB1.19骨肉瘤細(xì)胞系中TSSC3的表達(dá)，檢測(cè)高表達(dá)TSSC3對(duì)骨肉瘤細(xì)胞自我更新能力及成瘤能力的影響。以明

10、確TSSC3在腫瘤干細(xì)胞干性維持中的作用。
　　 第三部分?jǐn)M采用不同載體穩(wěn)定上調(diào)或下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中TSSC3的表達(dá)，檢測(cè)凋亡相關(guān)印跡基因TSSC3對(duì)骨肉瘤干細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，以及在化療藥物順鉑的作用下，骨肉瘤干細(xì)胞凋亡率的變化，并以MThFOB1.19為模型，利用RT-PCR、免疫熒光、western-blot等檢測(cè)凋亡通路中相關(guān)分子的表達(dá)變化，以明確TSSC3誘導(dǎo)骨肉瘤干細(xì)胞凋亡的可能通路，進(jìn)而尋找TSSC3誘導(dǎo)骨肉瘤干細(xì)胞

11、凋亡的可能機(jī)制。
　　 主要結(jié)果如下：
　　 一、成功分離和鑒定出骨肉瘤干細(xì)胞
　　 1.采用干細(xì)胞培養(yǎng)法分離骨肉瘤干細(xì)胞，結(jié)果顯示：①在干細(xì)胞培養(yǎng)基中，MG63、SaOS2和MThFOB1.19細(xì)胞均能形成腫瘤干細(xì)胞球；②MThFOB1.19較MG63和SaOS2細(xì)胞具有更高的腫瘤干細(xì)胞形成率，分別為：67.09±9.28%，5.40±1.06%和8.60±1.16%；③MThFOB1.19腫瘤干細(xì)胞球高表達(dá)干

12、性因子Nanog.Oct4和Sox2；說(shuō)明骨肉瘤干細(xì)胞可來(lái)源于分化的成骨細(xì)胞；
　　 2.在MThFOB1.19細(xì)胞中：①絕大部分細(xì)胞能形成克隆和亞克隆，比例分別為100%和92.7±4.29%，表明該細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新能力；②克隆細(xì)胞成瘤能力強(qiáng)，5×104細(xì)胞即可誘導(dǎo)腫瘤形成；③具有向脂肪方向分化的能力；④細(xì)胞高表達(dá)干性因子Nanog、Oct4和Sox2，說(shuō)明該細(xì)胞系中大部分細(xì)胞具有腫瘤起始細(xì)胞的特點(diǎn)；
　　 3.

13、采用干細(xì)胞表面標(biāo)記分選骨肉瘤干細(xì)胞，結(jié)果顯示：在SaOS2細(xì)胞中，CD133+、CD117+和Stro-1+細(xì)胞比例分別為：0.4%、4.8%和3.3%，說(shuō)明在該細(xì)胞中干性標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞非常少，表明不同細(xì)胞系具有不同的腫瘤干細(xì)胞比例，與細(xì)胞本身特性相關(guān)。
　　 二、發(fā)現(xiàn)印跡基因TSSC3在骨肉瘤干細(xì)胞中低表達(dá)，高表達(dá)TSSC3降低MThFOB1.19細(xì)胞的干性和抑制骨肉瘤生長(zhǎng)
　　 1.印跡基因TSSC3在骨肉瘤干細(xì)胞中

14、低表達(dá)：①在MG63、SaOS2和MThFOB1.19腫瘤干細(xì)胞球中，TSSC3在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá)均較貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞低；②在SaOS2細(xì)胞中，CD133+、CD117+和Stro-1+細(xì)胞TSSC3的表達(dá)分別較CD133-、CD117-和Stro-1-細(xì)胞的表達(dá)低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明TSSC3基因的低表達(dá)可能在維持骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞特殊功能中起重要作用；
　　 2.針對(duì)TSSC3，成功構(gòu)建RU486可誘導(dǎo)表達(dá)載體系統(tǒng)

15、。將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)染入MThFOB1.19細(xì)胞后，在濃度為1μg/ml的米非司酮誘導(dǎo)下，TSSC3的表達(dá)在mRNA水平和蛋白水平都明顯升高，最終在蛋白水平升高約5倍；
　　 3.在MThFOB1.19細(xì)胞中，高表達(dá)TSSC3降低骨肉瘤干細(xì)胞干性和抑制骨肉瘤生長(zhǎng)：①高表達(dá)TSSC3降低干細(xì)胞球形成率，由66.12±9.36%減少到46.82±8.37%；②高表達(dá)TSSC3降低細(xì)胞的克隆形成率，由95.32±4.58%減少到57.57±2

16、.16%；③高表達(dá)TSSC3減少克隆中的細(xì)胞數(shù)量；④高表達(dá)TSSC3在體內(nèi)抑制骨肉瘤的生長(zhǎng)，在第6周的時(shí)候，高表達(dá)TSSC3克隆來(lái)源的腫瘤體積較對(duì)照細(xì)胞來(lái)源的腫瘤體積減少約78.56%；⑤高表達(dá)TSSC3降低干性因子Nanog、Oct4和Sox2的表達(dá)；Nanog降低最為顯著，與對(duì)照相比降低了80%，Oct4和Sox2分別降低了20%和40%。
　　 三、高表達(dá)TSSC3通過(guò)線粒體途徑增加骨肉瘤干細(xì)胞自然凋亡率
　　 1

17、.差異表達(dá)SaOS2細(xì)胞中的TSSC3影響骨肉瘤干細(xì)胞比例：①在體外低表達(dá)TSSC3增加骨肉瘤干細(xì)胞比例，高表達(dá)TSSC3降低骨肉瘤干細(xì)胞比例；②在體內(nèi)高表達(dá)TSSC3降低骨肉瘤干細(xì)胞比例，低表達(dá)TSSC3增加骨肉瘤干細(xì)胞比例：
　　 2.高表達(dá)TSSC3通過(guò)線粒體途徑增加骨肉瘤干細(xì)胞的自然凋亡率：①高表達(dá)TSSC3增加SaOS2細(xì)胞中CD133+、CD117+和Stro-1+細(xì)胞的自然凋亡率；②高表達(dá)TSSC3增加MThFOB

18、1.19干細(xì)胞球中細(xì)胞的自然凋亡率；③高表達(dá)TSSC3增加MThFOB1.19干細(xì)胞球中Caspase3、Bak、Bim、Cytc、Apaf-1、Noxa和Puma的表達(dá)，增加Bax：Bcl2的比值，減少Caspase3前體蛋白和Caspase9前體蛋白，Caspase8前體蛋白無(wú)明顯改變；④高表達(dá)TSSC3降低MThFOB1.19干細(xì)胞球細(xì)胞的線粒體膜電位；
　　 3.高表達(dá)TSSC3增強(qiáng)化療藥物順鉑對(duì)SaOS2細(xì)胞中CD13

19、3+、CD117+和Stro-1+細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。
　　 主要的結(jié)論如下：
　　 1.大部分MThFOB1.19細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性，表明骨肉瘤干細(xì)胞可來(lái)源于分化的成骨細(xì)胞；在不同骨肉瘤細(xì)胞系中，腫瘤干細(xì)胞的比例存在差異，與細(xì)胞本身特性相關(guān)；
　　 2.印跡基因TSSC3在骨肉瘤干細(xì)胞中低表達(dá)，表明TSSC3基因的低表達(dá)可能在維持骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞特殊功能中起重要作用；高表達(dá)TSSC3可降低腫瘤干細(xì)胞干性抑制

20、腫瘤生長(zhǎng)，提示TSSC3可成為靶向腫瘤干細(xì)胞治療的靶點(diǎn)。
　　 3.高表達(dá)TSSC3通過(guò)線粒體途徑增加骨肉瘤干細(xì)胞的自然凋亡率，并增加化療藥對(duì)骨肉瘤干細(xì)胞的殺傷作用，提示可通過(guò)激活TSSC3基因的表達(dá)而發(fā)揮對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用。深入研究TSSC3誘導(dǎo)骨肉瘤干細(xì)胞凋亡的機(jī)制，可為骨肉瘤的治療策略提供新的思路；
　　 本研究首次報(bào)道了骨肉瘤的腫瘤干細(xì)胞可來(lái)源于分化的成骨細(xì)胞，并進(jìn)一步從印跡基因角度探討了TSSC3參與骨肉