黑曲霉IME-216產(chǎn)木聚糖酶的條件優(yōu)化及基因在釀酒酵母中的高效表達(dá).pdf

1、木聚糖酶作為重要的工業(yè)酶制劑，在飼料、造紙、食品、醫(yī)藥以及生物能源等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。燃料酒精被認(rèn)為最有發(fā)展前景的可再生清潔能源之一。而木聚糖酶在實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇中起著重要作用。 本課題對(duì)篩選到的一株酸性木聚糖酶高產(chǎn)菌株IME-216進(jìn)行形態(tài)觀察和18SrDNA基因的分子系統(tǒng)進(jìn)化分析，鑒定為黑曲霉(Aspergillus niger strain)。通過(guò)單因素和均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化了黑曲霉菌株IME-216(A

2、spergillus niger strain IME-216)產(chǎn)胞外木聚糖酶的液體發(fā)酵條件，確定最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基為：玉米芯5.0％，麩皮0.5％，纖維物質(zhì)1％，玉米漿1.1％，(NH4)2SO40.8％，蛋白胨0.8％，CaCO30.5％，KH2PO40.23％，MgSO4·7H2O0.08％，微量元素(Mandels)0.08％，pH自然。最佳發(fā)酵條件為：接種量5％(2.0×107)，28℃，250rpm振蕩培養(yǎng)96h。經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)，酶

3、活力由50000 U/ml，提高到90000 U/ml，增加了近50％。 由于發(fā)酵條件優(yōu)化是對(duì)菌株產(chǎn)酶潛力的發(fā)掘，它對(duì)酶活的改善是有限的，為進(jìn)一步提高酶活以適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的要求，本文運(yùn)用分子生物學(xué)手段構(gòu)建了一株分泌型高效表達(dá)木聚糖酶的釀酒酵母工業(yè)菌株。首先通過(guò)RT-PCR的方法獲得黑曲霉菌株IME-216的內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶(endo-β-1，4-xylanase)的cDNA序列。以釀酒酵母載體pUG6為基本骨架，用組成型

4、的磷酸甘油激酶(phosphoglycerate kinase，PGK)強(qiáng)啟動(dòng)子取代原來(lái)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，通過(guò)重疊延伸PCR的方法將其與α-factor信號(hào)肽，endo-xylanase成熟肽和細(xì)胞色素c(Cytochrome c transcription，CYCl)的終止子融合，得到的融合片段插入載體pUG6的Spel和Sacll位點(diǎn)，構(gòu)成載體pUPX。為了獲得木聚糖酶基因在釀酒酵母中的高拷貝整合，將擴(kuò)增得到的2.2 kb的釀酒酵母r