相對低劑量己烯雌酚影響小鼠睪丸引帶細(xì)胞的非基因效應(yīng)機(jī)理研究.pdf

1、目的:
　　目前,已得到大量資料證實(shí)環(huán)境雌激素(environment estrogens,EEs)危害生殖健康,并可能影響到人類的繁衍,但相對低劑量(與環(huán)境密切相關(guān)的低劑量)EEs對人類生殖的影響還少有研究。睪丸是男性生殖系統(tǒng)中的重要器官,現(xiàn)在研究表明,胚胎期睪丸的發(fā)育和生長不全與生后人體的健康成長,特別是成年后的生育功能和性功能異常,以及腫瘤等的發(fā)生關(guān)系密切,而胚胎期睪丸的發(fā)育過程又與睪丸引帶的發(fā)育過程緊密關(guān)聯(lián)。本課題組的前期

2、研究已表明己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES),一種經(jīng)典的代表性EEs,能夠影響睪丸引帶細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能,且在相對低劑量的作用下,有可能通過G蛋白偶聯(lián)的雌激素膜受體(G protein-coupled estrogen receptor 1,GPER)介導(dǎo),對小鼠睪丸引帶細(xì)胞產(chǎn)生快速作用,影響它們的生長及增殖等。本實(shí)驗(yàn)將在GPER介導(dǎo)的快速非基因效應(yīng)方面研究相對低劑量DES影響小鼠睪丸引帶細(xì)胞的可能機(jī)理。

3、　　材料和方法:
　　1.選擇合適血清濃度行小鼠睪丸引帶細(xì)胞原代培養(yǎng)
　　脫頸椎處死出生后三天雄性昆明小鼠25只,手術(shù)放大鏡下切取睪丸引帶組織,制成細(xì)胞懸液后接種于六孔板中,分別按10％、15%、20%的濃度加入兩種不含雌激素的胎牛血清混勻后置于孵育箱中靜置培養(yǎng),觀察24h、36h、72h的小鼠睪丸引帶細(xì)胞生長情況。同法選25只雄性昆明小鼠并切取其睪丸引帶組織用3個(gè)25cm2的培養(yǎng)瓶進(jìn)行原代培養(yǎng),將不同濃度(10%、15%、

4、20%)的同種血清加入無雌激素DMEM中行細(xì)胞培養(yǎng),觀察3天小鼠睪丸引帶細(xì)胞的生長情況。
　　2.GPER阻斷劑(G15)干預(yù)下,DES對小鼠睪丸引帶細(xì)胞增殖性的影響
　　選擇Ⅱ代小鼠睪丸引帶細(xì)胞,利用CCK-8法檢測在GPER阻斷劑(G15)干預(yù)下相對低劑量DES(1.5×10-8mol/L)(作用時(shí)間實(shí)驗(yàn)組分別為0、5、10、15、30、60min、1.5h、3h)對小鼠睪丸引帶細(xì)胞增殖性的影響。
　　3.經(jīng)典ER

5、阻斷劑(ICI182780)和GPER阻斷劑(G15)分別干預(yù)下,相對低劑量DES對小鼠睪丸引帶細(xì)胞GPER及相關(guān)蛋白磷酸化表達(dá)的影響
　　選擇Ⅱ代小鼠睪丸引帶細(xì)胞,用ER阻斷劑ICI182780和GPER阻斷劑G15分別預(yù)作用后,研究相對低劑量DES對細(xì)胞GPER、p-CREB和p-ERK1/2表達(dá)的影響:利用Western-blot技術(shù)檢測相對低劑量DES(1.5×10-8mol/L)分別作用不同時(shí)間(0、5、10、15、30

6、、60min、1.5h、3h)時(shí)的情況,并設(shè)置空白對照組。分組情況說明,DES組:只加DES;ICI182780-DES組:ICI 182 780預(yù)作用1.5h后加DES;G15-DES組:G15預(yù)作用20min后加DES。
　　結(jié)果:
　　1.原代細(xì)胞培養(yǎng):6孔板培養(yǎng)中,不同血清組顯示出相同的細(xì)胞生長趨勢,均觀察到10%的濃度組細(xì)胞生長慢,異形細(xì)胞多;15%的濃度組細(xì)胞生長較快,但分叉較多,胞體飽滿欠佳,72h不能達(dá)到理想

7、融合狀態(tài);20%的濃度組細(xì)胞生長快,基本伸展完全,細(xì)胞飽滿,分叉少,72h達(dá)到理想的細(xì)胞融合狀態(tài)。同樣取材量下,3個(gè)25cm2培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞僅在72h20%的血清濃度下生長情況好,能達(dá)到比較理想的細(xì)胞融合狀態(tài)。
　　2.CCK-8方法檢測發(fā)現(xiàn):GPER阻斷劑G15可在相對較短的時(shí)間(10min)內(nèi)抑制相對低劑量DES對小鼠睪丸引帶細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)

8、:
　　1)GPER表達(dá):ER阻斷劑ICI 182 780能明顯促進(jìn)GPER表達(dá)(P<0.05),GPER阻斷劑G15能明顯抑制GPER的表達(dá)(P<0.05)。
　　2)p-CREB的表達(dá)情況:相對于空白組,DES組:10min前未見明顯變化,15min開始出現(xiàn)明顯下降(P<0.05);ICI182780-DES組:各時(shí)間組均出現(xiàn)不同程度的下降(P<0.05);G15-DES組:5min表達(dá)降低,10min下降達(dá)到最低值(P

9、<0.05),15min開始升高(P<0.05)。ICI 182 780-DES組與DES組相比,各時(shí)間段p-CREB的表達(dá)均明顯降低(P<0.01);G15-DES組與DES組比較,10min組明顯降低(P<0.05),15min后出現(xiàn)不同程度的升高(P<0.01)。
　　3)p-ERK1/2的表達(dá)情況:相對于空白組,DES組:5min開始增加,10min達(dá)到最大(P<0.05);ICI 182 780-DES組0min增高(P

10、<0.01),其他組均有不同程度的抑制,(P<0.01);G15-DES組(除3h外)均有不同程度升高(P<0.05);ICI182780-DES組與DES組比較,0min升高(P<0.01),其余時(shí)間段均有不同程度降低(P<0.05);G15-DES與DES組比較,10min、15min、30min、1.5h升高(P<0.05),0min、1h、3h的p-ERK1/2表達(dá)明顯降低(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.常規(guī)

11、實(shí)驗(yàn)條件下,選擇20%血清濃度的無雌激素培養(yǎng)基可以很好地實(shí)現(xiàn)小鼠睪丸引帶細(xì)胞的原代培養(yǎng)。
　　2.GPER阻斷劑G15可抑制相對低劑量DES對小鼠睪丸引帶細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用。
　　3.經(jīng)典ER阻斷劑ICI182780可阻斷傳統(tǒng)ER受體,同時(shí)也可激動GPER,并在相對較長的時(shí)間內(nèi)影響相對低劑量DES對細(xì)胞PKA和ERK1/2信號通路蛋白p-CREB和p-ERK1/2的表達(dá)。
　　4.GPER阻斷劑G15僅能在相對較短的時(shí)