FGFR2在顱骨缺損修復(fù)和骨形成中的作用研究.pdf

1、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors,FGFs)及其受體(fibroblast growth factor receptors,FGFRs)在骨骼發(fā)育中發(fā)揮重要作用,其功能增強型突變可導(dǎo)致包括軟骨發(fā)育不全(Achondroplasia,ACH)、顱縫早閉(craniosynostosis,CS)等在內(nèi)的多種人類骨骼遺傳病。FGFRs屬于酪氨酸激酶受體家族,目前發(fā)現(xiàn)有4個成員,均由胞外的配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)

2、和胞內(nèi)高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)三部分構(gòu)成。類似其它酪氨酸激酶受體,FGFRs在與配體FGFs結(jié)合后,發(fā)生二聚化反應(yīng)激活FGFRs胞內(nèi)段的酪氨酸激酶活性,從而經(jīng)Ras-MAPK、PI3K-AKT及PLC-γ等通路向下游傳遞信號,發(fā)揮生物學(xué)功能。
　　FGFR2是FGFRs家族參與骨骼發(fā)育過程的重要成員,主要在顱縫成骨前體細胞、成骨細胞及長骨骨膜中表達。FGFR2兩種功能增強型點突變(S252W、P253R)可引起Apert綜合征,表現(xiàn)為

3、冠狀縫早閉、短頭畸形、顱面發(fā)育不良并伴嚴(yán)重的并指。FGFR2跨膜區(qū)功能降低型突變則引起B(yǎng)BD綜合征(Bent Bone Dysplasia,BBD),患者表現(xiàn)為顱縫早閉、面部發(fā)育畸形及長骨彎曲。Fgfr2敲除小鼠在胚胎期10.5天死亡,出現(xiàn)包括顱骨和肢體(limb)在內(nèi)的多個器官發(fā)育障礙。間質(zhì)細胞條件敲除 Fgfr2小鼠表現(xiàn)為頭顱畸形、體型矮小、生長遲緩、骨密度下降。上述結(jié)果提示FGFR2在骨骼發(fā)育特別是顱骨發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。

4、>　　顱骨缺損后再生修復(fù)在一定程度上是局部顱骨的再發(fā)育過程,多種調(diào)控骨骼發(fā)育的分子如Wnts、FGFs、BMPs等都參與顱骨缺損后再生修復(fù)過程。鑒于FGFR2在骨骼發(fā)育特別是顱骨發(fā)育中的重要作用,FGFR2可能參與了顱骨缺損后的再生修復(fù)過程,但其具體作用及詳細機制不清。為了探索FGFR2在其中的作用及相關(guān)機制,我們基于CreER(T2)-Loxp系統(tǒng)建立了成年期FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強小鼠,在排除早期發(fā)育對成骨影響的基礎(chǔ)上,通過

5、建立顱骨缺損模型觀察FGFR2對顱骨損傷修復(fù)的影響并探討其可能的機制。
　　機械性骨髓消融(Mechanical bone marrow ablation,BMX)可引起損傷后骨髓腔內(nèi)膜內(nèi)成骨過程,可較好的用于研究基因在骨形成和骨重建中的作用。因 BMX后的骨形成和顱骨缺損后的骨再生過程均為膜內(nèi)成骨過程,我們進一步在第二部分利用BMX模型,研究FGFR2對骨形成的影響,可從另一側(cè)面驗證FGFR2在顱骨缺損修復(fù)中的作用。
　　

6、方法:
　　第一部分:FGFR2在顱骨缺損修復(fù)中的作用和機制研究
　　1.建立FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強小鼠顱骨缺損模型;
　　2.利用 Micro-CT實時動態(tài)觀察顱骨缺損后2周、4周、8周缺損愈合過程,并定量測量缺損愈合面積;利用X線攝片觀察顱骨缺損后8周缺損愈合情況;
　　3.組織病理 H.E染色觀察顱骨缺損后8周缺損邊緣骨形成情況;
　　4.定量PCR檢測顱骨缺損后兩周顱骨成骨分化相關(guān)基因Ru

7、nx2、ColI、OP、OC的表達變化;
　　5.FGFR2P253Rneo/+;EIIa-Cre小鼠顱骨成骨細胞分離培養(yǎng),細胞計數(shù)及 MTT測定增殖情況;FGFR2P253Rneo/+;CMV-CreER(T2)成骨細胞4-羥基他莫昔芬處理后,經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化,通過ALP染色和定量PCR檢測成骨分化相關(guān)基因Runx2、ColI、OP、OC的表達觀察成骨分化情況;Western Blot檢測磷酸化ERK1/2蛋白水平變化;
　

8、　6.定量 PCR檢測成骨誘導(dǎo)14天后經(jīng)典 Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因 Dvl2、β-catenin、Tcf-1的表達。
　　第二部分:FGFR2功能增強對BMX后骨形成的影響
　　1.通過X線攝片和Micro-CT觀察BMX后1周和2周骨形成情況;
　　2.通過H.E染色和成骨細胞形態(tài)計量觀察BMX后1周和2周成骨細胞的功能活性;
　　3.定量PCR檢測BMX后2周成骨分化相關(guān)基因Runx2、Col

9、I、OP、OC的表達;
　　4.通過TRAP染色和破骨細胞形態(tài)計量觀察BMX后1周和2周破骨細胞的功能活性;
　　5.定量PCR檢測BMX后2周TRAP、CTSK、RANKL、OPG表達及RANKL/OPG的比值。
　　結(jié)果:
　　一、FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強小鼠顱骨缺損愈合加快,成骨能力增強
　　1.Micro-CT掃描顯示顱骨缺損后2周、4周、8周,FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強小鼠缺損未愈合

10、面積較野生小鼠減少,定量測量顯示顱骨缺損后8周 FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強小鼠缺損愈合百分比明顯高于野生小鼠;H.E染色顯示顱骨缺損后8周FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強小鼠缺損邊緣新生骨組織較野生小鼠多;
　　2.定量PCR結(jié)果顯示顱骨缺損后2周,FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強小鼠缺損周圍骨組織Runx2、ColI、OP、OC的表達較野生小鼠高;
　　3.FGFR2P253R/+功能增強顱骨成骨細胞增殖加快、分化增

11、強;
　　(1)細胞計數(shù)及 MTT檢測提示 FGFR2P253R/+功能增強顱骨成骨細胞增殖加快;經(jīng)成骨誘導(dǎo)后ALP活性增加,成骨分化相關(guān)基因Runx2、ColI、OP表達上調(diào)。
　　(2)FGFR2P253R/+功能增強顱骨成骨細胞磷酸化ERK1/2蛋白水平升高。
　　(3)FGFR2P253R/+功能增強顱骨成骨細胞經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路中Dvl2、Tcf1表達上調(diào),β-catenin表達不變。

12、r>　　二、FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強小鼠BMX后骨形成增加、骨吸收過程延遲。
　　1.X線和Micro-CT掃描顯示BMX后1周和2周FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強小鼠骨形成增加。
　　2.H.E染色和成骨細胞形態(tài)計量顯示BMX后1周和2周FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強小鼠新生骨組織中成骨細胞數(shù)增加,定量PCR結(jié)果顯示BMX后2周FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強小鼠新生骨組織中成骨分化相關(guān)基因Runx2、ColI

13、、OC表達上調(diào)。
　　3.TRAP染色和破骨細胞形態(tài)計量顯示BMX后1周FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強小鼠破骨細胞活性較野生小鼠低,而BMX后2周,FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強小鼠破骨細胞活性卻較野生小鼠高;同時野生小鼠破骨細胞活性在BMX后1周較高,第2周明顯降低,相反, FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強小鼠破骨細胞活性在 BMX后2周較高,提示FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強小鼠BMX后骨吸收過程延遲。
　　結(jié)論:

14、
　　1.FGFR2功能增強促進小鼠顱骨缺損的愈合和成骨活性;
　　2.FGFR2功能增強促進顱骨成骨細胞的增殖;FGFR2功能增強促進了Runx2的表達,繼而上調(diào) ColI、OP的表達促進顱骨成骨細胞的分化;這一作用可能部分通過激活ERK1/2 MAPK信號通路實現(xiàn)的;
　　3.FGFR2功能增強可能通過經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路促進成骨細胞的分化;
　　4.FGFR2功能增強促進BMX后的骨形成,