鴨疫里默氏桿菌OmpA蛋白的免疫原性研究.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌（Riemerella antipestifer,RA）能引起鴨、鵝、火雞等多種禽類發(fā)生鴨疫里默氏桿菌感染，呈急性或慢性敗血性經(jīng)過。本研究對RAOmpA基因開展了生物信息學(xué)分析、克隆表達(dá)、蛋白純化、多克隆抗體制備、基于OmpA蛋白間接ELISA方法的建立、重組蛋白免疫原性等研究，主要結(jié)果如下:
　　1 RA OmpA基因的生物信息學(xué)分析
　　RAOmpA全基因長1208bp，由397個(gè)氨基酸編碼大小為43.52

2、kDa的蛋白，等電點(diǎn)(pI)為4.81。該蛋白沒有信號(hào)肽切割位點(diǎn)和跨膜區(qū)，有如下功能位點(diǎn):有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，9個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，7個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)。亞細(xì)胞定位分析該蛋白主要分布于外膜和細(xì)胞之內(nèi)。氨基酸進(jìn)化樹分析表明該蛋白與黃桿菌科編碼OmpA蛋白的其它成員相似性低。該蛋白的抗原性分析表明第185-337位這段氨基酸有連續(xù)而且強(qiáng)烈的抗原性。
　　2 RA OmpA基因的克隆表達(dá)和多抗的制備

3、r>　　對RAOmpA基因設(shè)計(jì)了一對引物，大小為1208bp，構(gòu)建pJET1.2/OmpA克隆載體及其pET32a(+)OmpA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21內(nèi)進(jìn)行原核表達(dá)，優(yōu)化的表達(dá)條件:在37℃，IPTG終濃度為0.4mmol/L誘導(dǎo)4h的最優(yōu)條件下重組蛋白能夠大量表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析蛋白大小約63kDa，并主要以可溶性形式表達(dá)于上清，并用切膠的方法純化該蛋白。純化的蛋白用兔抗RAATCC菌為一抗，HRP-抗兔為二抗經(jīng)Wes

4、tern blot證實(shí)，該蛋白具有較好的反應(yīng)原性。最后，將純化的蛋白制備兔抗多克隆抗血清，用瓊擴(kuò)的方法測定效價(jià)為1∶16。
　　3基于OmpA蛋白間接ELISA方法的建立
　　用純化的重組蛋白作為包被抗原，用鴨抗RA ATCC全菌血清作為一抗，HRP-羊抗鴨為二抗進(jìn)行條件的優(yōu)化，最后結(jié)果為，當(dāng)包被的濃度為3.6125μg/mL;一抗最佳稀釋度為1∶100，最佳反應(yīng)時(shí)間為1.5h;二抗最佳稀釋度1∶400，最佳反應(yīng)時(shí)間為2h;

5、用1％BSA為封閉液;底物作用時(shí)間為30min時(shí)的反應(yīng)條件最佳;并用優(yōu)化好的條件對26份陰性血清做了陰陽性臨界值確定，根據(jù)公式，當(dāng)OD450＞0.379時(shí)可判為陽性，當(dāng)OD450≤0.294時(shí)可判為陰性;重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明變異系數(shù)均小于11％，表明該方法具有較好的重復(fù)性;對其它5種常見鴨病的陽性血清均無交叉反應(yīng)性，說明具有較好的特異性。
　　4重組蛋白免疫原性的研究
　　用純化的重組蛋白作為免疫原，對雛鴨進(jìn)行免疫，實(shí)驗(yàn)分組: