鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)上清中分泌蛋白的初步研究.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）是里默氏桿菌屬的代表種，主要感染鴨和鵝，火雞和其他禽類及野鳥類也能感染。感染鴨呈急性敗血癥或慢性過程，以纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征，因病鴨死亡率高、消瘦、生長發(fā)育遲緩、品質(zhì)下降、疾病治療等給世界范圍的養(yǎng)鴨業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。鴨疫里默氏桿菌已報(bào)道的的血清型至少有21個(gè)，但各血清型之間缺乏有效的交叉保護(hù)，這給鴨疫里默氏桿菌病疫苗的研制帶來困難。另外，目前對(duì)于

2、鴨疫里默氏桿菌的致病機(jī)制及保護(hù)性抗原等還知之甚少。
　　分泌蛋白在細(xì)菌間的信號(hào)傳遞、致病性以及免疫等方面起著重要的作用。本試驗(yàn)首先提取了鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)上清中的分泌蛋白，通過免疫蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)提取的分泌蛋白中有免疫原性的蛋白進(jìn)行鑒定和分析，并比較了不同菌株間分泌蛋白點(diǎn)的差異，為分析鴨疫里默氏桿菌的毒力相關(guān)基因和保護(hù)性抗原等提供一些信息。
　　1.鴨疫里默氏桿菌分泌蛋白的提取
　　采用三氯乙酸（Trichloroa

3、cetic acid，TCA）-乙醇沉淀法提取了鴨疫里默氏桿菌強(qiáng)毒株HXb2（血清10型）、YXb1（血清10型）、弱毒株NJ-1（血清1型）菌株在37℃TSB培養(yǎng)基中的分泌蛋白。經(jīng)Bradford法定量，HXb2、YXb1、NJ-1株培養(yǎng)上清中分泌蛋白的濃度分別為12.34、11.16和4.52μg·μL-1。
　　2.雙向凝膠電泳（2-D）鑒定分泌蛋白樣品中蛋白點(diǎn)
　　對(duì)提取的三株鴨疫里默氏桿菌的分泌蛋白分別進(jìn)行雙向凝膠

4、電泳分離，經(jīng)免疫印跡技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜MALDI-TOF-MS鑒定到具有免疫原性的蛋白點(diǎn)。共測定了42個(gè)蛋白點(diǎn)，鑒定到了24種蛋白質(zhì)。
　　經(jīng)GO（gene onthlog）蛋白質(zhì)功能分類數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析，這24種蛋白中有18種蛋白可以預(yù)測其亞細(xì)胞定位。除了翻譯延伸因子、滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)蛋白和分子伴侶定位在細(xì)胞質(zhì)外，其余蛋白均為膜蛋白，推測是外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）的成份。另

5、外，這24種蛋白可能參與22種生物過程（biological process）和15種分子功能（molecular function）等有關(guān)。KEGG pathway蛋白質(zhì)代謝數(shù)據(jù)庫預(yù)測18種能分析亞細(xì)胞定位的蛋白主要與碳水化合物代謝及其他氨基酸代謝有關(guān)。
　　檢測的42個(gè)蛋白點(diǎn)（24種蛋白）中有36個(gè)具有免疫原性，除了三種假定蛋白（gi|516282769、gi|441482924、gi|874269116）及外膜蛋白OmpH外