組蛋白去乙酰化酶抑制劑對燙傷大鼠小腸腸屏障損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:以往研究表明，嚴(yán)重?zé)齻蠼M織缺氧能激活缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號通路，損害腸上皮屏障功能，組蛋白去乙?；敢种苿?HDACIs)能保護(hù)腸缺血引起的胃腸道屏障及遠(yuǎn)隔器官損害，但其具體的機(jī)制還不十分清楚，本研究假設(shè)HDACIs通過增加HIF-1乙?；健⒁种艸IF-1功能，保護(hù)燙傷應(yīng)激時(shí)腸上皮細(xì)胞的屏障功能。研究內(nèi)容包括:1.采用大鼠50％TBSAⅢ度燙傷模型，研究腹腔內(nèi)給予HDACIs能否減少HIF-1的表達(dá)，減輕腸屏障功能

2、損害;2.通過腸上皮細(xì)胞低氧培養(yǎng)模型，研究HDACIs下調(diào)HIF-1、保護(hù)腸上皮屏障功能的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1、動物實(shí)驗(yàn)
　　動物分組:64只清潔級大鼠，體重240g-260g，購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。術(shù)前12小時(shí)禁食，自由飲水。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為4組①假燙對照組（SC組）②燙傷組（SN組）③SAHA治療燙傷組（SS組）④PA治療燙傷組(SV組);每組根據(jù)觀察時(shí)間點(diǎn)不同又分燙傷后3h(S3)和燙傷后6h(S6)兩

3、個亞組，（每個亞組n=8）
　　模型制作:取大鼠，稱重，標(biāo)號，戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔內(nèi)注射，麻醉成功后，備背部和腹部皮膚，假燙對照組大鼠置于37℃溫水中，燙傷組大鼠置于100℃熱水中，背部浸潤15s，腹部浸潤8s，假燙后在假燙對照組大鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.25ml，燙傷后在燙傷組大鼠腹腔內(nèi)依次注射0.25ml生理鹽水、SAHA(7.5mg/kg，溶于0.25ml生理鹽水中)、丙戊酸鈉(300mg/kg，溶于0.25ml

4、生理鹽水中)，分別在傷后3h和6h從腹主動脈取血標(biāo)本、于回腸末端留取腸組織。
　　指標(biāo)檢測:①紫外分光光度計(jì)檢測血清中二胺氧化酶(DAO)活性;②熒光顯微鏡觀察免疫熒光雙標(biāo)法標(biāo)記后的腸上皮細(xì)胞中ZO-1的變化;③用免疫印跡的方法測定腸組織中ZO-1和HIF-1α的含量;④運(yùn)用多普勒血流儀監(jiān)來測定腸黏膜血流量(IMBF)的變化;
　　2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　細(xì)胞分組:取凍存Caco-2細(xì)胞，快速復(fù)蘇后進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞隨機(jī)分為

5、四組①正常對照組(NC組)②缺氧組（H組）③SAHA治療缺氧組(5uM)(HS組)④VPA治療缺氧組(2mM)(HV組);
　　模型制作:細(xì)胞融合達(dá)到95％以上時(shí)，分別用DMSO、Cocl2(1mM)+DMSO、 Cocl2(1mM)+SAHA(5uM)、 Cocl2(1 mM)+VPA(2mM)+DMSO、刺激24h，24h后留取上清液，取胞漿液。
　　指標(biāo)檢測:①紫外分光光度計(jì)檢測血清液中二胺氧化酶(DAO)活性;②用免

6、疫印跡的方法測定胞漿中HIF-1α的含量;③免疫共沉淀方法檢測胞漿中HIF-1α乙酰化水平
　　結(jié)果:
　　動物實(shí)驗(yàn):
　　1血清中DAO活性:燙傷組DAO活性較假燙對照組明顯升高，(P＜0.05)，HDACIs治療燙傷組較燙傷組明顯降低，(P＜0.05)，SAHA治療燙傷組（SS組）較VPA治療燙傷組（SV組）明顯降低，(P＜0.05)。
　　2腸組織中緊密連接蛋白ZO-1:(1)免疫印跡法分析，與假燙對照組比

7、較，燙傷組蛋白表達(dá)明顯減少;HDACIs治療燙傷組顯著高于燙傷組，SAHA治療燙傷組(SS組)較VPA治療燙傷組（SV組）高;(2)觀察免疫熒光，相比燙傷組，假燙對照組腸粘膜ZO-1呈陽性顯示，熒光信號強(qiáng)，呈現(xiàn)出連續(xù)的狀態(tài);HDACIs治療燙傷組熒光信號強(qiáng)于燙傷組(P＜0.05)，SAHA治療燙傷組（SS組）熒光信號強(qiáng)于VPA治療燙傷組（SV組），(P＜0.05)。
　　3 HIF-1α Western blot:較假燙對照組，燙

8、傷組HIF-1α表達(dá)顯著增多(P＜0.05)，而HDACIs治療燙傷組低于燙傷組(P＜0.05)，SAHA治療燙傷組（SS組）低于VPA治療燙傷組（SV組），（P＜0.05）。
　　4腸黏膜血流量:相比假燙對照組，燙傷組IMBF明顯降低，(P＜0.05)，HDACIs治療燙傷組較燙傷組明顯升高，(P＜0.05)，SAHA治療燙傷組(SS組)較VPA治療燙傷組（SV組）明顯上升，(P＜0.05)。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn):
　　1

9、上清液中DAO活性
　　缺氧組DAO活性相比空白對照組明顯增大，(P＜0.05)，而HDACIs治療缺氧組較缺氧組明顯降低，(P＜0.05)，SAHA治療缺氧組較VPA治療缺氧組明顯降低，(P＜0.05)。
　　2 HIF-1α Western blot:缺氧組HIF-1α蛋白水平較空白對照組顯著升高(P＜0.05)，而HDACIs治療缺氧組HIF-1α蛋白水平較缺氧組較顯著減少(P＜0.05)， SAHA治療缺氧組較VPA

10、治療缺氧組顯著減少(P＜0.05)。
　　3 HIF-1α乙?；?通過免疫共沉淀方法能夠檢測HIF-1α乙?；?，缺氧組HIF-1α乙酰化水平不明顯，HDACIs治療缺氧組HIF-1α乙酰化水平較缺氧組顯著升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1 HDACIs能抑制大鼠燙傷后腸上皮ZO-1的降解，降低腸上皮細(xì)胞通透性，保護(hù)腸屏障功能，SAHA的保護(hù)作用優(yōu)于VPA。
　　2 HDACIs能夠增加HIF-1α