豬圓環(huán)病毒2型重組腺病毒載體疫苗的構(gòu)建及其免疫原性研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒相關(guān)性疾病（PCVAD）是由豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)引起的豬傳染性疾病。接種疫苗是防控PCVAD最有效的手段，重組腺病毒載體疫苗已經(jīng)有相關(guān)報道，但是由于腺病毒自身蛋白可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而限制了這種疫苗在臨床實踐中的應(yīng)用，如何降低自身免疫應(yīng)答反應(yīng)成為重組腺病毒載體疫苗規(guī)?；瘧?yīng)用必須解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。本研究構(gòu)建了4類PCV2重組腺病毒載體疫苗，一是利用人巨細(xì)胞病毒第一內(nèi)含子(Intron A)和土撥鼠肝炎病

2、毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)，構(gòu)建Intron A和/或WPRE優(yōu)化的PCV2重組腺病毒載體疫苗;二是通過共表達(dá)豬腫瘤壞死因子相關(guān)激活蛋白(tumor necrosis factor related activation protein，TRAP/CD40L)和粒細(xì)胞-巨細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GMCSF），構(gòu)建CD40L和/或GMCSF優(yōu)化的P

3、CV2重組腺病毒載體疫苗;三是分別在CD40L、Cap和GMCSF的N端添加分泌型信號肽，構(gòu)建分泌型重組腺病毒載體疫苗;四是分別在CD40L和GMCSF的N端添加分泌型信號肽，Cap N端添加跨膜型信號肽，構(gòu)建跨膜型重組腺病毒載體疫苗。4類重組腺病毒載體疫苗均進(jìn)行動物試驗評價免疫效果，期望構(gòu)建的這4類PCV2重組腺病毒載體疫苗能夠提高PCV2Cap的表達(dá)效率和表達(dá)方式，從而降低腺病毒疫苗免疫劑量，減弱腺病毒載體自身的免疫原性，增強(qiáng)疫苗免

4、疫效果，為PCV2重組腺病毒載體疫苗的規(guī)?；瘧?yīng)用奠定基礎(chǔ)。研究取得以下結(jié)果。
　　1.將Intron A和WPRE克隆到PCV2重組腺病毒，構(gòu)建PCV2Cap、Intron A和WPRE相關(guān)重組腺病毒疫苗，分別命名為Ad-C、Ad-A-C、Ad-C-W和Ad-A-C-W。western blotting結(jié)果表明，在Ad-C、Ad-A-C、Ad-C-W和Ad-A-C-W感染細(xì)胞的蛋白樣品中均可檢測到Cap表達(dá)，并且Ad-A-C-W感

5、染細(xì)胞的Cap表達(dá)量高于其他組。IFA結(jié)果表明，Ad-C、Ad-A-C、Ad-C-W和Ad-A-C-W感染的細(xì)胞均能檢測到熒光，并且Ad-A-C-W感染細(xì)胞的熒光信號強(qiáng)于其他組。使用上述構(gòu)建的重組腺病毒免疫小鼠2次，間隔14d。結(jié)果表明，一免后14d開始檢測到特異性抗體和中和抗體。一免后35d至一免后56d，Ad-A-C-W免疫組特異性抗體水平和中和抗體水平顯著高于其他組(p＜0.05)，Ad-A-C免疫組和Ad-C-W免疫組特異性抗體

6、水平和中和抗體水平差異不顯著，但均顯著高于Ad-C免疫組(p＜0.05)。一免后28d至一免后56d，Ad-A-C-W免疫組淋巴細(xì)胞增殖水平、IFN-γ和IL-4分泌水平顯著高于其他組(p＜0.05)，Ad-A-C免疫組和Ad-C-W免疫組差異不顯著，但均顯著高于Ad-C免疫組(p＜0.05)。
　　2.將CD40L和GMCSF克隆到PCV2重組腺病毒，構(gòu)建PCV2Cap、CD40L和GMCSF相關(guān)重組腺病毒疫苗，分別命名為Ad-

7、CD40L-Cap、Ad-Cap-GMCSF和Ad-CD40L-Cap-GMCSF。western blotting和IFA結(jié)果顯示，重組腺病毒Ad-CD40L-Cap、Ad-Cap-GMCSF和Ad-CD40L-Cap-GMCSF均可以檢測到相應(yīng)蛋白表達(dá)。使用上述構(gòu)建的重組腺病毒免疫小鼠2次，間隔14d。結(jié)果表明，一免后14d開始檢測到特異性抗體和中和抗體。一免后21d至一免后56d，Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫組特異性抗

8、體水平和中和抗體水平顯著高于其他組(p＜0.05)，Ad-CD40L-Cap免疫組和Ad-Cap-GMCSF免疫組特異性抗體水平和中和抗體水平差異不顯著，但均顯著高于Ad-Cap免疫組(p＜0.05)。一免后28d至一免后56d，Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫組淋巴細(xì)胞增殖水平、IFN-γ和IL-4分泌水平顯著高于其他組(p＜0.05)，Ad-CD40L-Cap免疫組和Ad-Cap-GMCSF免疫組差異不顯著，但均顯著高于Ad

9、-Cap免疫組(p＜0.05)。
　　3.將重組腺病毒Ad-Cap、Ad-A-C-W和Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫豬，進(jìn)行免疫保護(hù)試驗，一免后14d加強(qiáng)免疫，一免后28d攻毒。結(jié)果顯示，一免后21d至一免后77d，Ad-A-C-W免疫組和Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫組特異性抗體水平和中和抗體水平顯著高于Ad-Cap免疫組(p＜0.05)。一免后28d，Ad-A-C-W免疫組淋巴細(xì)胞增殖水平和IFN-γ和IL

10、-13水平顯著高于Ad-Cap免疫組(p＜0.05)，但是顯著低于Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫組(p＜0.05)。一免后35d至一免后91d，Ad-A-C-W免疫組和Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫組病毒載量均顯著低于Ad-Cap免疫組(p＜0.05)。一免后91d試驗結(jié)束后對各試驗組豬進(jìn)行了尸體剖檢和組織病理學(xué)檢查。Ad-Cap免疫組、Ad-A-C-W免疫組和Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫組均未見明顯的解

11、剖病理變化，鏡檢也未見明顯的組織學(xué)病變。
　　4.首先構(gòu)建重組腺病毒Ad-A-CD40L-Cap-GMCSF-W，然后分別在CD40L、Cap和GMCSF N端添加分泌信號肽，構(gòu)建重組腺病毒Ad-A-spCap-W和Ad-A-spCD40L-spCap-spGMCSF-W，分別在CD40L和GMCSF N端添加分泌型信號肽，Cap N端添加跨膜型信號肽，構(gòu)建重組腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMC SF-W。we

12、stern blotting結(jié)果表明，Ad-A-spCap-W和Ad-A-spCD40L-spCap-spGMCSF-W感染細(xì)胞上清中可檢測到Cap表達(dá)，Ad-A-CD40L-Cap-GMCSF-W和Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W感染細(xì)胞裂解蛋白中可檢測到Cap表達(dá)，Ad-A-spCD40L-spCap-spGMCSF-W和Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W感染細(xì)胞上清可檢測到CD40L和

13、GMCSF表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡觀察Ad-A-CD40L-Cap-GMC SF-W表達(dá)的Cap主要定位于PK15細(xì)胞質(zhì)，Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W表達(dá)的Cap主要定位于PK15細(xì)胞膜。
　　5.將45頭豬隨機(jī)分為9組，每組5頭，分別接種重組腺病毒Ad-Cap（組1）、Ad-A-spCap-W(組2)、Ad-A-CD40L-Cap-GMC SF-W(組3)、Ad-A-spCD40L-spCap-spGM

14、CSF-W(組4)、Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W(組5)、商品化疫苗（組6）和空載體腺病毒Ad-wild（組7），第8組為非免疫攻毒組（組8），第9組為空白對照組（組9），評價疫苗的保護(hù)效果。一免后14d加強(qiáng)免疫，一免后28d攻毒。結(jié)果顯示，一免后28d至一免后49d，組2特異性抗體水平顯著低于組6(p＜0.05)，其余時間點與組6差異不顯著。一免后35d至一免后63d，組3特異性抗體水平顯著高于組6(p＜0

15、.05)。一免后14d至一免后70d，組4和組5特異性抗體水平顯著高于組6(p＜0.05)。western blotting結(jié)果表明，一免后14d，組2、組3、組4和組5豬血清就可以與Cap特異性結(jié)合。一免后14d至一免后70d，組2中和抗體水平與組6差異不顯著。一免后35d至一免后63d，組3中和抗體水平顯著高于組6(p＜0.05)。一免后21d至一免后70d，組4和組5中和抗體水平顯著高于組6(p＜0.05)。一免后28d，組2和組

16、3淋巴細(xì)胞增殖水平和IFN-γ和IL-13水平與組6差異不顯著，組4和組5淋巴細(xì)胞增殖水平和IFN-γ和IL-13水平顯著高于組6(p＜0.05)。一免后35d至一免后70d，組2病毒載量和組6差異不顯著。一免后49d至一免后70d，組3病毒載量顯著低于組6(p＜0.05)。一免后42d至一免后70d，組4和組5病毒載量均顯著低于組6(p＜0.05)。一免后70d，對各組豬進(jìn)行尸體剖檢和組織病理學(xué)檢查，組2、組3、組4和組5豬均未見明顯

17、病理變化。
　　本研究通過對腺病毒載體進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建了4類PCV2重組腺病毒疫苗，第一類是Intron A和/或WPRE優(yōu)化的PCV2重組腺病毒疫苗;第二類是CD40L和/或GMCSF優(yōu)化的PCV2重組腺病毒疫苗;第三類是分別在CD40L、Cap和GMCSF N端添加分泌型信號肽的重組腺病毒疫苗;第四類是分別在CD40L和GMCSF N端添加分泌型信號肽，CapN端添加跨膜型信號肽的重組腺病毒疫苗。動物試驗結(jié)果表明，新構(gòu)建的4類疫

18、苗均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。其中，第一類疫苗中的Ad-A-C-W和第二類疫苗中的Ad-CD40L-Cap-GMCSF動物免疫效果優(yōu)于單一Intron A、WPRE、CD40L和GMCSF的PCV2重組腺病毒疫苗，并且前者優(yōu)于后者，但是它們的免疫效果與商品化疫苗仍有差距。第三類疫苗中Ad-A-spCD40L-spCap-spGMCSF-W和第四類疫苗中Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W對豬的免疫保護(hù)效