常見(jiàn)腸道致病菌感染快速診斷芯片的研制與應(yīng)用.pdf

1、細(xì)菌感染是臨床的重要問(wèn)題，1995年全世界世界死亡5200萬(wàn)人，至少1200萬(wàn)死于傳染病，占死亡人數(shù)的32.7％，其中就包括細(xì)菌性傳染病。目前培養(yǎng)法是細(xì)菌感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但費(fèi)時(shí)長(zhǎng)(4-7天)，而且不同的細(xì)菌培養(yǎng)條件也不相同，也不易同時(shí)鑒定多種細(xì)菌。國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了利用分子生物學(xué)及免疫學(xué)方法對(duì)致病菌進(jìn)行檢測(cè)的研究，包括定性分析的PCR技術(shù)、ELISA及免疫磁珠等，但是這些方法都只是特異的對(duì)單種細(xì)菌來(lái)進(jìn)行鑒定。而DNA芯片技術(shù)，作為一種大規(guī)模

2、集成的固相雜交技術(shù)，具有高通量的特點(diǎn)，而且所需鑒定時(shí)間短(2天)，可能成為細(xì)菌感染檢測(cè)的重要方法。因此本研究擬采用不對(duì)稱PCR，熒光顯色等技術(shù)建立一種檢測(cè)常見(jiàn)腸道細(xì)菌感染的芯片系統(tǒng)，來(lái)對(duì)引起腹瀉的常見(jiàn)的致病菌做一個(gè)初步的篩查，初步確定到屬，然后再選擇進(jìn)行特異性的鑒定(如熒光定量PCR)。這樣不僅能夠特異的檢測(cè)靶細(xì)菌感染，而且可以大大的節(jié)省臨床培養(yǎng)所耗費(fèi)的時(shí)間，有可能在臨床得到廣泛應(yīng)用。 研究目的：建立一種快速準(zhǔn)確的方法對(duì)引起腹瀉

3、的常見(jiàn)腸道致病菌做初步的篩查，并對(duì)早期的治療和最后的診斷起指導(dǎo)作用。 材料和方法： 1.根據(jù)表一和表二中的引起腸道感染的常見(jiàn)致病菌的相關(guān)流行病學(xué)資料，確定將臨床14屬細(xì)菌作為研究對(duì)象。 2.收集GeneBank中臨床常見(jiàn)的14屬細(xì)菌的16SrDNA的60條序列，利用計(jì)算機(jī)中DNAStar軟件對(duì)些序列進(jìn)行比對(duì)，Primer5.0軟件在保守區(qū)中設(shè)計(jì)通用引物，在可變區(qū)中設(shè)計(jì)特異性探針。 3.培養(yǎng)腸致病性大腸桿菌

4、、蠟狀芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌，單核增生型李斯特菌、嗜水氣單胞菌、志賀菌、傷寒沙門(mén)菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、空腸彎曲菌、副溶血弧菌、艱難梭菌、普通變形桿菌等常見(jiàn)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株。抽取各菌種的DNA后于-20℃下保存。 4.將cy5標(biāo)記后的引物以不對(duì)稱PCR方法擴(kuò)增上述提取的細(xì)菌DNA后，與固定在芯片上的探針進(jìn)行雜交，然后在熒光掃描儀中進(jìn)行掃描，根據(jù)雜交后產(chǎn)生的熒光信號(hào)值強(qiáng)弱來(lái)判定細(xì)菌的種類。 5.收集住院和門(mén)診腹

5、瀉病人的糞便200例及正常人糞便50例。 6.提取250例糞便的DNA，并應(yīng)用此引物和探針進(jìn)行檢測(cè)。以傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)評(píng)價(jià)DNAmicroarray方法的敏感度，特異度，假陰性率以及假陽(yáng)性率。 結(jié)果： 1.在對(duì)細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株的檢測(cè)中，我們建立的針對(duì)16SrRNA序列的基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)，能夠成功的將14屬的細(xì)菌鑒定到屬。在純培養(yǎng)物的最低檢測(cè)濃度為103CFU/ml。在模擬糞便標(biāo)本中的最低檢測(cè)濃度為104CF

6、U/ml。 2.在200例腹瀉糞便中，DNAmicroarray檢出93例陽(yáng)性樣本，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢出89例。其中培養(yǎng)方法陽(yáng)性，芯片結(jié)果陰性5例；培養(yǎng)方法陰性，芯片結(jié)果陽(yáng)性9例。以傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法作為檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片的敏感度為94.4％，特異度為91.8％，假陽(yáng)性率為5.6％，假陰性率為10％。 3.在對(duì)檢測(cè)出的空腸彎曲菌(4例)和小腸結(jié)腸炎耶爾森(6例)菌同時(shí)進(jìn)行real-timePCR檢測(cè)，其結(jié)果與芯片結(jié)果吻合

7、度為100％。 結(jié)論： 1.引物和探針對(duì)常見(jiàn)的腸道致病菌有較強(qiáng)的特異性。在純培養(yǎng)物的最低檢測(cè)濃度為103CFU/ml。在模擬糞便標(biāo)本中的最低檢測(cè)濃度為104CFU/ml。 2.在對(duì)臨床200例糞便標(biāo)本的檢測(cè)中，以同時(shí)進(jìn)行的糞便培養(yǎng)作為評(píng)價(jià)的金標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片的敏感度為94.4％，特異度為91.8％，假陽(yáng)性率為5.6％，假陰性率為10％，表明引物和探針的最低檢測(cè)濃度能夠應(yīng)用于臨床檢測(cè)中。 3.DNAmicro