食源性致病菌快速檢測方法的建立及其試劑盒的研制與應(yīng)用.pdf

1、食源性致病菌是危害食品安全和人類健康的主要因素。近年來，食品安全事件頻發(fā)，不僅影響到人們的生活、工作和健康，更是關(guān)系到國計民生的大事。隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的提高，食品安全問題越來越受到重視。我國流行的食源性疾病中，細(xì)菌性食物中毒居首位，因此，食品中食源性致病菌檢測是食品衛(wèi)生安全檢測中一個重要的部分。常見的食源性致病菌包括沙門氏菌、致病性大腸桿菌、彎曲桿菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌及毒素、蠟樣芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、變形桿菌屬、阪崎

2、腸桿菌、李斯特菌、結(jié)腸炎耶爾森氏菌、志賀氏菌等。面對日益增加的多重混合污染，目前的檢測方法顯得滯后，因此建立快速、高效、準(zhǔn)確的食源性致病菌的檢測方法已成當(dāng)務(wù)之急。
　　 多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)?？朔顺Ｒ?guī)PCR方法單一、費時、繁瑣等缺點，從而實現(xiàn)了多種食源性致病菌的快速同時檢測，多重PCR檢測方法有著更為廣闊的發(fā)展空間。
　　 本研究針對空腸彎曲桿菌(Campy

3、lobacterjejuni)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)、阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)6種食源性致病菌建立了多重PCR快速檢測方法。分別根據(jù)空腸彎曲桿菌的馬尿酸酶hipO基因、副溶血弧菌的不耐熱溶血

4、毒素tlh基因、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的粘附侵襲位點Ail基因以及阪崎腸桿菌的16S核糖體16SrRNA基因、產(chǎn)氣莢膜梭菌的磷脂酶cpa基因、奇異變形桿菌的Tu延伸因子tuf基因設(shè)計6對特異性引物，PCR擴增的目的基因片段長度分別為1028bp、450bp、274bp、282bp、120bp、541bp。建立多重PCR檢測方法，并研制出兩套三重PCR試劑盒，實現(xiàn)了6種食源性致病菌的同時檢測。
　　 對多重PCR反應(yīng)體系中引物添加量、

5、鎂離子濃度、dNTPmixture添加量及退火溫度和循環(huán)數(shù)等影響要素通過L20(55)正交試驗確定最佳反應(yīng)體系，確定了適宜的多重PCR反應(yīng)體系和擴增程序，即優(yōu)化的三重PCR反應(yīng)體系為：50μL反應(yīng)體系中，10×PCRBuffer5μL，Mg2+(25mM)3μL，dNTPmixture(25mM)4μL，Taq酶(5U)1μL，模板各2μL，hipO、tlh和Ail終摩爾量分別為15pmol、5pmol和7.5pmol，16SrRNA、

6、cpa和tuf終摩爾量分別為5pmol、15pmol和5pmol，雙蒸水補足至50μL；兩套多重PCR試劑盒擴增循環(huán)參數(shù)為：多重PCR反應(yīng)采用冷啟動，94℃預(yù)變性5min；然后變性(94℃，30s)，退火(57℃，40s)，延伸(72℃，70s)，35個循環(huán)，最后72℃延伸15min。
　　 反應(yīng)產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。對多重PCR擴增產(chǎn)物膠回收后連接到pMD18-T載體上轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5α中

7、，陽性克隆質(zhì)粒進行DNA測序，登錄Genebank將測序結(jié)果進行網(wǎng)上blast同源性比對，從而證實PCR擴增產(chǎn)物確為目的擴增產(chǎn)物。
　　 試驗中利用人工污染的肉及乳制品，對6種食源性致病菌的特異性、靈敏度進行同時檢測。其中副溶血弧菌、阪崎腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的多重PCR靈敏度與單重PCR相比，低一個梯度；而其他三種致病菌與單重相比靈敏度不變?？漳c彎曲桿菌的檢出極限為3.0×101cfu/ml，副溶血弧菌的檢出極限為6.2×101

8、cfu/ml，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢出極限為1.5×101cfu/ml；阪崎腸桿菌的檢出極限為1.9×101cfu/ml，產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢出極限為5.8×101cfu/ml，奇異變形桿菌的檢出極限為2.4×101cfu/ml。
　　 應(yīng)用本試驗研制的兩套三重試劑盒，對泰安地區(qū)食源性致病菌的流行情況進行實際樣品檢測。從泰安各農(nóng)貿(mào)市場、家禽屠宰市場、家禽零售處、家禽交易市場等采集雞的糞便、羽毛、新鮮雞肉、冷凍雞肉及其屠宰用水、屠宰用

9、具等樣品409份；從泰安某奶牛場和超市采集新鮮牛奶及奶粉樣品392份。經(jīng)檢測，樣本中85份檢出空腸彎曲桿菌，陽性率20.8％，6份檢出副溶血弧菌，陽性率1.5％，54份檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，陽性率13.2％；1份檢出阪崎腸桿菌，陽性率0.1％，48份檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌，陽性率6.0％，48份檢出奇異變形桿菌，陽性率6.0％。將多重PCR方法的檢測結(jié)果與國標(biāo)法進行比較，符合率為100％。
　　 由試驗結(jié)果得知：本研究建立的多重PC