中國人超重及肥胖人群中SHP基因突變的遺傳及臨床特征研究.pdf

1、肥胖被定義為身體過分增加的脂肪量以至于對身體健康產(chǎn)生有害結(jié)果的一種狀態(tài)。研究表明肥胖與2型糖尿病、代謝綜合征、某些癌癥、高血壓以及腦卒中在內(nèi)的疾患有關(guān),很清楚的是超重和肥胖的流行帶來了巨大的公共衛(wèi)生問題。依照世界衛(wèi)生組織(WHO)所制定的肥胖或超重標(biāo)準(zhǔn),統(tǒng)計表明在西方國家,目前超過半數(shù)的成人表現(xiàn)為超重抑或肥胖。近年來在中國由于傳統(tǒng)飲食的改變、體力活動強度的下降和靜態(tài)生活方式的增加導(dǎo)致超重和肥胖人數(shù)迅速增加。盡管與美國等西方國家超過半數(shù)的

2、成人超重或肥胖相比,中國的肥胖患病率相對較低,但是肥胖病的快速增長,特別是兒童的情況,給我們敲響了警鐘。肥胖病是由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用所導(dǎo)致的復(fù)雜疾病。盡管當(dāng)前飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變導(dǎo)致了全球肥胖發(fā)病率的增加,但有證據(jù)表明遺傳因素在體重的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用。肥胖為一種復(fù)雜病,復(fù)雜病是由多個易感遺傳基因與環(huán)境因素共同參與且相互作用而致發(fā)病,目前闡明多基因決定因素在肥胖人群中參與發(fā)病的作用機制并非易事。然而,研究孟德爾遺傳模式的單

3、基因突變所致的肥胖為解析肥胖的發(fā)病機制提供了幫助。最近,研究發(fā)現(xiàn)幾種涉及破壞瘦素-黑皮質(zhì)素通路的單基因突變可導(dǎo)致早發(fā)性嚴(yán)重肥胖的發(fā)生,他們是:瘦素、瘦素受體、激素原轉(zhuǎn)換酶-1、阿片黑色素促皮質(zhì)素原和黑皮素4受體基因突變。這些基因編碼的蛋白質(zhì)直接或間接地調(diào)控/參與中樞黑皮素通路,從而影響著能量代謝的平衡。然而這些基因突變導(dǎo)致的肥胖多只在白種人群中發(fā)現(xiàn),且除MC4R基因突變發(fā)生率較高外,其他基因突變在人群中發(fā)生率極低,只在白人人群中個別散發(fā)

4、出現(xiàn)。Nishigori等發(fā)現(xiàn)小異二聚體伙伴基因突變在日本人群中和輕度肥胖的發(fā)生共分離(突變發(fā)生率約為6％),證實SHP基因突變和顯性遺傳的早發(fā)性輕度肥胖相關(guān)聯(lián)。盡管缺乏SHP基因突變和日本人成人肥胖發(fā)生相關(guān)性的研究,但他們推測SHP基因突變是導(dǎo)致日本人肥胖發(fā)生的遺傳背景成分之一。但隨后對白種人的篩查發(fā)現(xiàn)功能性SHP基因突變的發(fā)生率很低。SHP基因位于1p36.1,SHP由2個外顯子及1個內(nèi)含子構(gòu)成,其編碼257氨基酸(aa)殘基構(gòu)成的

5、蛋白質(zhì)SHP是核受體超家族的一個成員。由于目前尚未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的配體,所以SHP是一種孤兒核受體,SHP屬于一類非典型性的核受體,其和傳統(tǒng)意義上的核受體在結(jié)構(gòu)和功能上存在相當(dāng)大的差異,其缺乏核受體所具有的保守的DNA結(jié)合區(qū)。迄今,已知涉及調(diào)節(jié)40多個不同的靶基因,這些靶基因主要涉及膽固醇/膽汁酸代謝,脂肪生成,糖異生,藥物代謝及類固醇生成。本實驗通過利用直接測序的方法對中國人超重或肥胖人群中SHP基因突變的發(fā)生率進行評價,然后利用雙熒光素酶

6、報告基因測試系統(tǒng)來檢測突變蛋白的功能,最后檢測突變攜帶者的臨床病理生理。評估中國人超重或肥胖人群中SHP基因突變的遺傳及臨床特征,為對SHP基因突變攜帶者進行早期臨床干預(yù)提供理論依據(jù)。本課題分為三個部分組成。
　　第一部分：中國人超重或肥胖人群中篩查SHP基因突變
　　目的:了解SHP基因突變及變異在中國人超重或肥胖人群中的發(fā)生情況以及探討SHP基因突變攜帶者表型、突變基因遺傳模式和突變的外顯性。
　　方法:應(yīng)用直接測

7、序方法對500例無親緣關(guān)系的超重抑或肥胖患者及272名非糖尿病非肥胖的健康個體進行SHP基因啟動子、2個外顯子及其側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)篩查。
　　結(jié)果:通過對500例無親緣關(guān)系超重或肥胖個體進行SHP基因篩查,在編碼區(qū)共發(fā)現(xiàn)11個個體攜帶5種不同的SHP基因突變位點,并且所有這些突變都是呈雜合狀態(tài)。其中在超重組所發(fā)現(xiàn)的突變:兩個先前國外報道過的錯義突變G171A和G189E分別在兩個不同的個體中被發(fā)現(xiàn);一個先前報道過的無義突變R34X也在

8、該組的一個個體中被發(fā)現(xiàn);一個先前報道過的移碼突變H53fsdel10在該組的5個無親緣關(guān)系的個體中被發(fā)現(xiàn);一個位于蛋白N端的新的沉默突變P10P也在該組中被發(fā)現(xiàn)。此外,我們在一個超重個體中發(fā)現(xiàn)了一個新的雜合變異IVS1+10 C→T。在肥胖組所發(fā)現(xiàn)的突變:我們發(fā)現(xiàn)2個無親緣關(guān)系的個體攜帶H53fsdel10突變(2.6%,2/77)。我們未在272例非糖尿病非肥胖健康正常對照組中發(fā)現(xiàn)上述突變。此外,本研究在家系中觀察到SHP基因突變并不

9、完全與肥胖或超重共分離,在研究中SHP基因突變的外顯率僅為62.5%(15/24)。
　　結(jié)論:SHP基因突變可能影響中國人體重的增加及升高的血漿胰島素水平。
　　第二部分：突變型SHP基因的表達及功能檢測
　　目的:研究SHP基因突變蛋白質(zhì)與正常SHP蛋白質(zhì)在抑制功能上的差異。
　　方法:本研究通過對攜帶突變SHP基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定,然后利用SHP蛋白能和核受體HNF-4α結(jié)合形成異二聚體并抑制HNF-4

10、α的轉(zhuǎn)錄激活功能,而HNF-1α基因作為HNF-4α的靶基因, HNF-4α可以結(jié)合到HNF-1α基因上游的啟動子部分從而對HNF-1α基因有轉(zhuǎn)錄激活功能的原理設(shè)計利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)來檢測SHP基因不同突變位點的功能。
　　結(jié)果:通過將攜帶SHP基因R34X、H53fsdel10、G171A及G189E突變位點的pcDNA3.1-SHP質(zhì)粒分別和質(zhì)粒pcDNA-HNF-4α、pGL3-HNF-1α及pRL-SV40共轉(zhuǎn)

11、染MIN-m9及HepG2細胞結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶R34X、H53fsdel10、G189E突變的SHP蛋白在不同的細胞株中其抑制功能均顯著低于野生型SHP蛋白;而G171A突變,其在HepG2細胞株中轉(zhuǎn)染,檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶該突變的SHP蛋白其抑制功能和野生型SHP蛋白無顯著性差異。而在MIN-m9細胞株中轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)其25ng水平時抑制功能和野生型SHP蛋白無顯著性差異,當(dāng)pcDNA3.1-SHP質(zhì)粒質(zhì)量加大5倍后,其抑制功能顯著低于野生型SHP

12、蛋白。
　　結(jié)論:R34X、H53fsdel10、G171A及G189E突變使SHP的轉(zhuǎn)錄抑制能力下降,這些突變可能與中國人超重或肥胖有關(guān)。
　　第三部分：SHP基因突變個體的臨床病理生理研究
　　目的:進一步研究SHP基因突變攜帶者的臨床病理生理特征,了解SHP基因突變在人體中對糖、脂代謝及其他內(nèi)分泌激素分泌的影響,為將來對SHP基因突變攜帶者進行臨床診治提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:本實驗擬通過測定SHP基因突變

13、攜帶者血中肥胖發(fā)生相關(guān)的激素水平以研究SHP基因突變是否伴發(fā)其他內(nèi)分泌異常;檢測血脂譜水平;以及通過對SHP基因突變攜帶者進行口服葡萄糖耐量試驗和精氨酸試驗來評估突變攜帶者的β細胞功能。
　　結(jié)果:通過對6例SHP基因H53fsdel10突變攜帶者肥胖發(fā)生相關(guān)的激素的測定發(fā)現(xiàn)SHP基因突變攜帶者肥胖相關(guān)激素水平皆在正常范圍之內(nèi),所有突變攜帶者肝腎功能正常,血脂譜水平多在正常水平。SHP基因突變攜帶者表現(xiàn)為高胰島素血癥及胰島素抵抗。

14、精氨酸試驗時,和2分鐘時SHP基因突變組胰島素分泌水平比較,正常對照組、單純性肥胖組及T2DM伴OB組的胰島素水平均顯著高于SHP基因突變組,而T2DM不伴OB組胰島素水平顯著低于SHP基因突變組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);和4分鐘時SHP基因突變組胰島素分泌水平比較,單純性肥胖組及T2DM伴OB組的胰島素水平均顯著高于SHP基因突變組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),而正常對照組及T2DM不伴OB組胰島素水平與SHP基因突