NDRG2調(diào)節(jié)骨髓間充干細(xì)胞成骨成脂分化機(jī)制的研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis)是一種以骨生成和骨吸收平衡破壞為特征的慢性炎癥性疾病。目前,能夠引起骨質(zhì)疏松發(fā)病的因素有很多,包括年齡,雌激素缺乏和炎癥性疾病等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)作為成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的前體細(xì)胞,其分化能力的變化對(duì)骨的生長(zhǎng)和發(fā)育有著至關(guān)重要的影響。因此,研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在疾病中生物學(xué)行為的變化及其作用機(jī)制,提高其成骨分化的能力,對(duì)于治療骨性疾病有著深遠(yuǎn)的意義。
　　NDRG2屬于NDRG(T

2、he N-myc downstream regulated gene)家族,是近年來越來越受到關(guān)注的一個(gè)基因,其在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡過程中均發(fā)揮著作用,尤其在癌癥發(fā)生過程中的作用被越來越多的文章報(bào)道,甚至有學(xué)者提出,NDRG2可能將會(huì)成為判斷癌癥預(yù)后的指標(biāo)。本課題組前期研究結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道均表明,NDRG2能都調(diào)節(jié)骨早期的生長(zhǎng)和發(fā)育,并且在正常和患有疾病的骨組織中NDRG2的表達(dá)有差異,在成骨和破骨細(xì)胞中,NDRG2的表達(dá)也不同。但是

3、在骨質(zhì)疏松疾病中,NDRG2是否調(diào)控了BMMSCs成骨成脂分化以及如何調(diào)控分化,它的表達(dá)和功能的變化是否受到其他因素的調(diào)節(jié),以及是怎樣調(diào)節(jié)的,目前還沒有明確。研究NDRG2對(duì)BMMSCs分化能力的調(diào)控以及在骨質(zhì)疏松疾病狀態(tài)下表達(dá)和功能的異常,對(duì)于探究BMMSCs成骨分化機(jī)制以及探索新的治療靶點(diǎn)具有指導(dǎo)意義。
　　研究目的:
　　1.探討NDRG2在BMMSCs成骨分化過程中的表達(dá);
　　2.探討NDRG2調(diào)控BMMSC

4、成骨分化的機(jī)制;
　　3.探討NDRG2在骨質(zhì)疏松疾病中表達(dá)和功能的異常及其作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.利用密度梯度法分離、純化、培養(yǎng)mBMMSCs,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物,成骨成脂誘導(dǎo)檢測(cè)mBMMSCs的分化能力,RT-PCR檢測(cè)成骨成脂誘導(dǎo)后標(biāo)志性基因的表達(dá)。
　　2.利用RT-PCR檢測(cè)NDRG2在mBMMSCs成骨成脂分化過程中表達(dá)的變化,通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)/下調(diào)NDRG2的表達(dá),體外

5、檢測(cè)NDRG2成骨成脂能力的變化;ALP、茜素紅和油紅O觀察堿性磷酸酶、鈣化結(jié)節(jié)和脂滴的形成情況,RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)成骨標(biāo)志性基因Runx2、Osterix和PPAR的表達(dá)。
　　3.在骨質(zhì)疏松疾病模型中探索NDRG2調(diào)節(jié)mBMSCs的作用機(jī)制。分離和培養(yǎng)正常和患有骨質(zhì)疏松小鼠的BMMSCs,對(duì)兩組細(xì)胞成骨成脂能力進(jìn)行比較,檢測(cè)兩種細(xì)胞中NDRG2的表達(dá)差異。體外模擬炎癥環(huán)境,檢測(cè)NDRG2的表達(dá),通過相關(guān)通

6、路抑制劑的加入,觀察成骨基因的變化,通過NDRG2的變化,尋找參與NDRG2調(diào)控BMMSCs分化的信號(hào)通路并探索其作用機(jī)制。通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式上調(diào)/下調(diào)NDRG2的表達(dá),檢測(cè)成骨基因表達(dá)的差異以及這種差異受外界環(huán)境的影響變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.通過分離培養(yǎng)的mBMMSCs表達(dá)間充干細(xì)胞表面標(biāo)志物而不表達(dá)其他造血系干細(xì)胞標(biāo)志物,成骨成長(zhǎng)誘導(dǎo)分化后,ALP,茜素紅,油紅O染色證明其具有成骨成脂分化的能力。
　　2

7、.通過芯片及RT-PCR驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn),NDRG2在成骨誘導(dǎo)以后表達(dá)升高。通過對(duì)其功能分析發(fā)現(xiàn),高表達(dá)NDRG2能夠抑制BMMSCs的體外成骨分化促進(jìn)其成脂分化,而下調(diào)NDRG2能夠促進(jìn)BMMSCs的成骨分化抑制其成脂分化。
　　3.骨質(zhì)疏松小鼠(早衰性和雌激素缺乏性)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與正常小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比,其成骨能力下降成脂能力增加;NDRG2在骨質(zhì)疏松小鼠的BMMSCs表達(dá)升高。LiCL,TNF-α抑制BMMSC的分

8、化能力,體外環(huán)境中加入LiCL,NDRG2的表達(dá)沒有明顯變化;加入TNF-α,NDRG2的表達(dá)下降。通過轉(zhuǎn)染NDRG2,能夠逆轉(zhuǎn)TNF-α對(duì)BMMSC的作用。
　　結(jié)論:
　　1.NDRG2能夠抑制BMMSCs的體外成骨能力促進(jìn)成脂能力。
　　2.NDRG2在正常和患有骨質(zhì)疏松癥小鼠中的表達(dá)存在差異。
　　3.NDRG2受TNF-α的調(diào)節(jié),NDRG2調(diào)控BMMSCs分化的過程與NF-κB信號(hào)通路有關(guān),與WNT信號(hào)