小型豬γ干擾素基因的克隆及原核表達(dá).pdf

1、干擾素是一類多功能細(xì)胞因子，是由哺乳動物體細(xì)胞合成與分泌的潛在的生物活性蛋白質(zhì)，具有抵抗病毒感染、抑制腫瘤細(xì)胞生長與調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用。其基因表達(dá)受多種因素和調(diào)控元件的調(diào)節(jié)。干擾素基因工程和基因治療研究引起了廣泛的關(guān)注，目前已被應(yīng)用于臨床治療。 豬IFN-γ具有強烈的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，作為生物藥劑和疫苗佐劑具有廣闊的應(yīng)用前景。廣西巴馬小型豬和貴州小型豬是品種優(yōu)良的地方豬種，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值與實用價值。廣西巴馬小

2、型豬和貴州小型豬IFN-γ基因的成功克隆和表達(dá)為豬IFN-γ的進(jìn)一步研究和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。 首先將廣西巴馬小型豬和貴州小型豬外周淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，刀豆蛋白A(ConA)刺激培養(yǎng)后，提取培養(yǎng)淋巴細(xì)胞總RNA。試驗結(jié)果表明，刺激培養(yǎng)24h提取的RNA質(zhì)量最高。 參照GenBank中已報道的豬IFN-γ基因(NO：S63967)設(shè)計引物P1和P2，引物5’端分別加BamHⅠ和HindⅢ酶切位點。引物序列，P1為CGCGGA

3、TCCATGAGTTATACAACTTATT；P2為CGAAGCTTAAATATTGCAGGCAGGATGAC。然后應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴增γ-干擾素(IFN-γ)基因，并克隆到PMD18-T載體上，經(jīng)過PCR鑒定、BamHⅠ/HindⅢ限制性酶切分析、測序證實擴增得到的IFN-γ基因序列正確。測序結(jié)果表明，與Vandenbroeck[11]等報道的豬INF-γcDNA的同源性為100﹪，與李江凌等[77]報道的成華豬和夏春等[57]報

4、道的大白豬的INF-γcDNA的同源性為99.8﹪，與閆麗萍等[13]報道的豬INF-γcDNA的同源性為99.6﹪。 用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切上述重組質(zhì)粒載體PMD18-T-IFN-γ，膠回收純化獲得連接用IFN-γ基因片段，與經(jīng)過同樣雙酶切的表達(dá)載體PET-22b(+)連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。PCR鑒定和酶切分析篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，再通過熱刺激法把構(gòu)建的表達(dá)載體PET-22b-IFN-γ導(dǎo)入大腸桿菌