豬γ干擾素基因克隆、表達(dá)及多克隆抗體制備.pdf

1、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文豬γ干擾素基因克隆、表達(dá)及多克隆抗體制備姓名：閆麗萍申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：魏萍;童光志20040601致 謝C l o n i n g a n d E x p r e s s i o n o f P o r c i n e I I i ' N 吖a n dP r e p a r a t i o n o f P o l y c l o n a l A n t i b o d i e s

2、 a g a i n s tI F N - 7A b s t r a c tI n t e r f e r o n i sa k i n do f h i 曲l y a c t i v ea n d m u l t i - f u n e t i u n a lg l u c o p r o t e i n p r o d u c e db ya c t i v a t e dc e i l s ．I n t e r f e r o n

3、i sd e r i d e d i n t oc l a s sIa n d c l a s s Ⅱ．L n t e r f e r o n - y ( I F N 吖) b e l o n g st oc l a s s I I ．P o r c i n e i n t e r f e r o n - 7i Sa l l a n t i v i r a lc y t o k i n e p r o d u c e d b y a c

4、 t i v a t e d T c e l l sa n d N K c e l l s ．I tu p r e g u l a t sM H C I I a n t i g e ne x p r e s s i o n , i n f l u e n c e s t h ec e l l u l a ra n d h u m o r a li m m u n er e s p o n s e sa n d h a s p l e i

5、 o 自' o p l cr e g u l a t o r ye f f e c t s o n i m m u n es y s t e m ．I n t h i s s t u d y , t h et o t a l R N A w a se x t r a c t e d f r o m p e r i p h e r a l b l o o d m o n o n u c l e a rc e l l s( P B

6、M C s ) ，i s o l a t e d f r o ma h e a l t h y p i g l e ta n ds t i m u l a t e dw i t h C o n A f o r 2 4h o u r s ．A n dt h ec D N Ao f p o r c i n e ] n t e r f e r o n - TO ] F N - v ) g e n e W a Sa m p l i f i e

7、d b y R 1 沖C R u s i n ga p a i ro f p r i m e r $d e s i g n e d a c c o r d i n g t ot h ep u b l i s h e d p o r c i n e I F N - y g e n es e q u e n c e ．T h eP C R p r o d u c t w a s c l o n e di n t op M D l 8 - T

8、v e c t o r ．1 1 Ⅺm o n e o f t h ep o s i t i v e r e c o m b i n a n t c l o n e s w e r e s e q u e n c e d a n da n a l y z e d ．C o m p a r i s o no f t h e s e q u e n c e d I F N 吖I ，。w i t h t h er e p o r t e d

9、p o r c i n eI F N 吖s e q u e n c e i nG e n B a n kr e v e a l e d 9 9 ．6 ％i d e n t i l y a t t h e ?n u c l e o t i d e l e v e l ．B y c o m p a r i n g o f t h eh o m o l o g y , p o r c i n e1 F N ．qg e n es h a r e

10、 s6 8 ．6 ％8 3 ‰8 3 ％．8 4 ．4 ％5 0 ．I ％3 1 ．5 ％4 1 ．9 ‰4 1 ％i d e n t i t i e sW i t hh u m a n , c a t t l e ，s h e e p , d e e r , r a t , m o n k e y , d o g , c h i c h e nI F N - 7 g e n ei nn u c l e o t i d e ，r e s

11、 p e c t i v e l y ．T h e p o r c i n e I F N - 5 , g e n ew a s s u b c l o n e d i n t oa ne x p r e s s i o nV e c t o rp E T - 3 0 & T h u s ，r e c o m b i n a n t e X p r e S S i o n p l a s m i d p E T - 3 0 a

12、- I F N - 7 W a s c O n 翻n l c t e d ．T h er e c o m b i n a n t p l u s m i dp E l ’_ 3 0 a - I F N 吖w a st r a n s f o r m e d i n t o 五c o l iB L 2 l c e l I s , a n di n d u e e d b yI P T G 砒3 7 ℃f o r 4h o u r s ．T

13、 h e r e c o m b i n a n t p o r c i n eJ F N q W a S e x p r e s s e de f f i c i e n t l yi nt h ef o r m o f i n c l u s i o nb o d yw i t h t h ey i e l da c c o u n t i n g f o r 3 9 ％o f t o t a l b a c t e r i a l

14、p r o m i m ．S D S ·P A G E a n d W e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i ss h o w e d t h a t t h e r e c o m b i n a n t f u s i o n p r o t e i n h a d a m o l e c u l a r w e i g h t o f a p p r o x i m a t e2

15、 5 k u , a n d h a d s p e c i a l r e a c t i v i t y ．T h ei n c l u s i o nb o d y W a s d e n a t u r e db y8 m o V L u r e a , p u r i f i e db yP r o B o n d T M P u d f i c a t i o nS y s t e r m ．a(chǎn) n d t h e n r

16、e f o l d e d b yd i a l y s i sa g a i n s t w a t e r ．T h et a r g e tp r o t e i nW a s h a r v e s t e d 謝t } I a c o n c e n t r a t i o n o f O ．3 m g ／m 1 ．A n d t h e a n t i s e r aa g a i n s t p o r c i n e I

17、 F N 吖w a sg e n e r a t e db yi m m u n i z i n g r a b b i t sw i t h t h ep u r i f i e dp r o t e i n ．T h ea n t i s e r ah a d i m m u n o l o g i c a lr e a c t l v i t yw i t ht h e e x p r e s s e df u s i o n p

18、 r o t e i nb yE L I S A a n a l y s i s ，T h i s s t u d y s u c c e e d e di nc l o n i n g , e x p r e s s i o na n d p u r i f i c a t i o no f t h e r e c o m b i n a n t p o r c i n eI F N - 7 f u s i o n p r o t e

19、 i n ，a n d p r e p a r a t i o n o f r a b b i t a n t i s e r aa g a i n s tp o r c i n e I F N 吖．T h i s p r o v i d e s aw e l lf o u n d a t i o n f o r f u r t h e rr e s e a r c h o np o r c i n e I F l q l b i o