表皮生長(zhǎng)因子受體變異體促進(jìn)上皮性卵巢癌侵襲及順鉑耐藥的研究.pdf

1、卵巢癌是導(dǎo)致女性癌癥患者死亡的第五大原因，但仍位居?jì)D科腫瘤中患者致死的第一位。在過(guò)去的25年中，雖然其生存率有所改善，卵巢癌患者的5年生存率仍低于50％。卵巢癌之所以預(yù)后不良，是因?yàn)橥砥诨颊甙l(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移和產(chǎn)生化療耐藥。卵巢癌主要分為三種類型，上皮細(xì)胞型、基質(zhì)細(xì)胞型和生殖細(xì)胞型。其中多數(shù)的卵巢癌屬于上皮性卵巢癌。
　　表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是一種跨膜糖蛋白，屬于受體酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體家族，參與重要的生理過(guò)程，如細(xì)胞的存活、

2、增殖和運(yùn)動(dòng)。在眾多人類腫瘤中，EGFR的過(guò)度表達(dá)都已被證實(shí)與腫瘤晚期和患者預(yù)后不佳具有密切相關(guān)性，如乳腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌和卵巢癌。在人類腫瘤中EGFR的編碼序列經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)改變。其胞外結(jié)構(gòu)域大部分的缺失的突變與患者預(yù)后不佳存在相關(guān)性。通常這些突變體能持續(xù)激活并使腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)能力，以及增加其惡性潛能。
　　最近，de4 EGFR，一種表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)第4外顯子缺失的變異體在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和卵巢癌中被發(fā)現(xiàn)。然

3、而，其對(duì)卵巢癌的生物學(xué)功能目前尚不清楚。在本課題中，我們對(duì)de4 EGFR在上皮性卵巢癌中的表達(dá)，以及其對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲力及耐藥性進(jìn)行了研究。
　　第一部分 de4 EGFR在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能
　　目的:檢測(cè)de4 EGFR在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及其對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為如增殖、侵襲等的影響。
　　方法:通過(guò)RT-PCR方法對(duì)12例正常卵巢組織及72例上皮性卵巢癌組織中de4EGF

4、R的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè);體外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)慢病毒感染的方法在三種不同上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、CAOV3、ES2中過(guò)表達(dá)EGFR及de4 EGFR，并通過(guò)Western blot方法驗(yàn)證其過(guò)表達(dá)的效率。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲的影響;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)在裸鼠體內(nèi)成瘤的方法評(píng)估de4 EGFR對(duì)裸鼠體內(nèi)瘤體大小與腫瘤重量的影響。
　　結(jié)果:研究結(jié)果顯示在上皮性卵巢癌組織有4

5、8.6％(35/72)的de4 EGFR表達(dá)。在正常卵巢組織中未檢測(cè)到de4 EGFR的表達(dá)。在Ⅲ-Ⅳ期的上皮性卵巢癌組織中，de4 EGFR的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ-Ⅱ期的上皮性卵巢癌組織。體外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，與GFP對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)de4 EGFR的細(xì)胞株與過(guò)表達(dá)EGFR的上皮性卵巢癌細(xì)胞株具有相似的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的能力(P＜0.05或P＜0.01)。在體外成瘤實(shí)驗(yàn)中，相比于GFP組，EGFR和de4 EG

6、FR組更能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)(P＜0.01和P＜0.05)。但是EGFR和de4 EGFR組之間沒(méi)有顯著差異。Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)de4 EGFR的SKOV3細(xì)胞的侵襲能力比對(duì)照組要高兩倍(P＜0.001)，在其余的細(xì)胞株CAOV3、ES2中也觀察到相同的現(xiàn)象(P＜0.001)。
　　結(jié)論:de4 EGFR在上皮性卵巢癌組織中普遍表達(dá)，并與臨床分期正相關(guān)。de4 EGFR可以促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖并且與EGFR相比其具

7、有更強(qiáng)的促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲的能力。
　　第二部分 de4 EGFR促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制研究
　　目的:研究de4 EGFR促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:通過(guò)慢病毒感染的方法在三種不同上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、CAOV3、ES2中過(guò)表達(dá)de4 EGFR，采用Western blot方法檢測(cè)de4 EGFR自身磷酸化及EGF刺激后磷酸化的情況，并研究de4 EGFR對(duì)下游信

8、號(hào)通路以及與侵襲相關(guān)因子Src，F(xiàn)AK，MMP-9和E-cadherin的影響。通過(guò)siRNA干擾的方法下調(diào)過(guò)表達(dá)de4 EGFR細(xì)胞株SKOV3、ES2中FAK的表達(dá)，以觀察FAK相關(guān)信號(hào)通路的變化及侵襲相關(guān)因子的改變;同時(shí)采用Transwell方法，在過(guò)表達(dá)de4 EGFR細(xì)胞株SKOV3中下調(diào)FAK的表達(dá)水平后，觀察上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲的變化。
　　結(jié)果:Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，de4 EGFR在上皮性卵巢癌細(xì)胞中

9、具有更高的自身酸磷酸化水平，且對(duì)EGF刺激不敏感。相比于GFP對(duì)照組及過(guò)表達(dá)EGFR的上皮性卵巢癌細(xì)胞，過(guò)表達(dá)de4 EGFR組可以明顯上調(diào)ERK、AKT、Src和FAK的磷酸化水平，并且上調(diào)MMP9而下調(diào)E cadherin的表達(dá)。在過(guò)表達(dá)de4 EGFR細(xì)胞株SKOV3中通過(guò)siRNA干擾下調(diào)FAK的表達(dá)水平后，明顯抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力（P＜0.05）。此外，下調(diào)FAK的表達(dá)水平后，在過(guò)表達(dá)de4 EGFR細(xì)胞株SKOV3

10、、ES2中可下調(diào)Src，ERK，AKT的磷酸化水平及MMP-9的表達(dá)，而上調(diào)E-cadherin的表達(dá)。
　　結(jié)論:de4 EGFR可能通過(guò)上調(diào)FAK磷酸化水平持續(xù)激活A(yù)KT和ERK通路，隨后增加MMP-9的表達(dá)，并下調(diào)E-cadherin的表達(dá)從而增強(qiáng)上皮性卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　第三部分 de4 EGFR促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥的初步研究
　　目的:研究de4 EGFR在上皮性卵巢癌細(xì)胞中對(duì)于順鉑耐藥的作

11、用。
　　方法:在轉(zhuǎn)染GFP、EGFR、de4 EGFR的兩種不同上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和CAOV3中，用不同劑量順鉑作用細(xì)胞后，通過(guò)CCK-8方法觀察順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況的影響，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。進(jìn)一步通過(guò)Western blot檢測(cè)順鉑處理上述細(xì)胞后相關(guān)信號(hào)通路如AKT，ERK及凋亡相關(guān)因子如Bcl-2與Bad的變化。
　　結(jié)果:de4 EGFR過(guò)表達(dá)的上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3對(duì)順鉑的抑制率

12、及凋亡率較GFP組及EGFR組明顯降低(P＜0.001及P＜0.01)。在CAOV3細(xì)胞中觀察到了相似的結(jié)果。相比于GFP組及EGFR組，轉(zhuǎn)染de4 EGFR的上皮性卵巢癌細(xì)胞AKT、ERK分子磷酸化水平升高，而且細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子如Bcl-2表達(dá)上調(diào)、Bad表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論:de4 EGFR可以增強(qiáng)上皮性卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥，其程度比EGFR更高。de4 EGFR可能通過(guò)激活A(yù)KT和ERK通路以及上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bad