CUEDC2和ATF6α調(diào)控心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致細(xì)胞凋亡作用的研究.pdf

1、背景與目的：
　　 心肌細(xì)胞的死亡，是急性心力衰竭發(fā)生和慢性心功能不全進(jìn)展的主要因素。研究調(diào)控心肌細(xì)胞死亡的分子機(jī)制并尋找促進(jìn)心肌細(xì)胞存活的新靶點，一直是心血管疾病基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是心肌細(xì)胞內(nèi)最重要的細(xì)胞器之一。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡是其發(fā)揮多種生物學(xué)功能的關(guān)鍵。低氧、鈣離子失衡、超負(fù)荷應(yīng)激等都會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERstress)并激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)。UPR通過緩解內(nèi)質(zhì)

2、網(wǎng)應(yīng)激，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡，促進(jìn)細(xì)胞存活；也能夠通過多種途徑激活NF-κB，引起炎癥反應(yīng)。如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在且不能緩解，UPR則通過上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但是，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，決定細(xì)胞最終走向存活或是凋亡的選擇機(jī)制尚不清楚。既往研究表明，UPR的IRE1和ATF6作用分支影響細(xì)胞死亡且作用效果與應(yīng)激持續(xù)時程相關(guān)，但是，確切的調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
　　 CUEDC2(CUE domain containing p

3、rotein 2)是一個功能尚不明確的蛋白質(zhì)。前期研究發(fā)現(xiàn)CUEDC2通過與GADD34相互作用招募蛋白磷酸酶1(Protein phosphatase 1，pp1)，使IKKβ去磷酸化，抑制NF-κB信號通路的持續(xù)激活，從而避免炎癥反應(yīng)過度和自身組織損傷，完成機(jī)體對炎癥反應(yīng)的精確調(diào)控。此外，CUEDC2還能介導(dǎo)雌激素受體ER和孕激素受體PR的泛素化降解，是乳腺癌耐藥的重要原因之一，并證明它能調(diào)控細(xì)胞周期，最終導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性和腫瘤發(fā)

4、生。但是CUEDC2在心臟中的作用尚無研究報道。生物信息學(xué)分析和前期預(yù)實驗結(jié)果均發(fā)現(xiàn)CUEDC2在心臟中高表達(dá)，提示其可能在心臟發(fā)育和功能中具有重要作用?；贑UEDC2對NF-κB活性調(diào)節(jié)和對多種重要蛋白質(zhì)泛素化修飾的功能基礎(chǔ)，以及UPR和NF-κB活性的相互影響，推測CUEDC2可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)中有重要功能。因此，本課題擬研究CUEDC2在急性和慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下參與細(xì)胞存活或凋亡的作用，尤其是對IRE1和ATF6α激活后生物

5、學(xué)效應(yīng)的影響及分子機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 本研究分四部分：
　　 第一部分：采用生物信息學(xué)方法分析CUEDC2基因在心臟中的表達(dá)、可能相互作用蛋白質(zhì)以及可能發(fā)生的翻譯后修飾，預(yù)測CUEDC2在心臟中的作用；利用已經(jīng)構(gòu)建成功的CUEDC2基因敲除雜合子小鼠，繁殖、鑒定得到CUEDC2基因敲除純和子小鼠和同窩野生型對照小鼠，比較Cuedc2-/-小鼠和野生型小鼠和在發(fā)育、心臟結(jié)構(gòu)和生理功能上的差異。
　

6、　 第二部分：建立心肌缺血再灌注模型，模擬急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，探討CUEDC2在急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用及可能機(jī)制。研究利用CUEDC2基因敲除小鼠，通過結(jié)扎和釋放左冠狀動脈前降支建立心肌缺血再灌注損傷在體模型，評價CUEDC2基因敲除對心肌梗死的影響；分離原代大鼠心肌細(xì)胞，用腺病毒載體干涉CUEDC2表達(dá)，模擬心肌缺血再灌注損傷，研究CUEDC2在細(xì)胞水平對細(xì)胞存活的影響，在此基礎(chǔ)上，研究CUEDC2影響細(xì)胞存活或凋亡的分子機(jī)制。

7、　　 第三部分：利用CUEDC2基因敲除小鼠，通過手術(shù)制作心室長期超負(fù)荷致心肌病理性肥厚和心功能不全動物模型，模擬慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，分別在動物整體和分子水平探討CUEDC2在慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用及分子機(jī)制。
　　 第四部分：慢性缺氧也會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。利用慢性缺氧先天性心臟病患兒心肌組織標(biāo)本，檢測CUEDC2在慢性缺氧心肌中的表達(dá)變化，在人的組織標(biāo)本中驗證CUEDC2在心肌慢性應(yīng)激時的表達(dá)變化；檢測UPR三個作用分支的活性水平

8、，并建立心肌細(xì)胞長時間低氧模型和低氧-復(fù)氧模型，研究活化程度最高的UPR分支在長期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用。
　　 研究結(jié)果：
　　 主要結(jié)果如下：
　　 1、CUEDC2在心臟中高表達(dá)；敲除CUEDC2基因后，小鼠的生長、發(fā)育不受影響；生理狀態(tài)下，野生型小鼠和Cuedc2-/-小鼠在心臟腔室大小和心功能指標(biāo)上均無顯著差異。
　　 2、在體動物和離體細(xì)胞模型中，缺血再灌注均會導(dǎo)致CUEDC2蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著降

9、低；敲除CUEDC2基因后，缺血再灌注損傷所致小鼠心肌梗死面積縮小約30％；在CUEDC2基因敲除的小鼠心肌組織和原代分離培養(yǎng)的MEF細(xì)胞中，缺血再灌注所致JNK激活受到明顯抑制；原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞中，干涉CUEDC2基因表達(dá)能顯著抑制缺血再灌注激活JNK并增加心肌細(xì)胞的存活率；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，CUEDC2與IRE1下游效應(yīng)激酶ASK1發(fā)生相互作用，是JNK磷酸化激活的關(guān)鍵。
　　 3、通過主動脈縮窄(TAC)致左心室長期超負(fù)荷應(yīng)

10、激，建立心肌肥厚和心功能不全小鼠模型。TAC術(shù)后2周心肌組織中CUEDC2蛋白質(zhì)表達(dá)下降；敲除CUEDC2基因后，心肌肥厚程度不受影響，但是顯著抑制了心功能不全的發(fā)展；TAC術(shù)后2周，分離小鼠心肌細(xì)胞，測量單細(xì)胞的收縮力和鈣處理能力，發(fā)現(xiàn)CUEDC2基因敲除后心肌細(xì)胞收縮力和鈣處理能力較野生型心肌細(xì)胞更好；TAC術(shù)后4周，提取心肌組織總蛋白，檢測SERCA2a蛋白質(zhì)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CUEDC2基因敲除后SERCA2a蛋白質(zhì)水平較高，表明SER

11、CA2a穩(wěn)定性增加；CUEDC2可能通過影響SERCA2a蛋白穩(wěn)定性和活性參與心室超負(fù)荷時心功能不全的發(fā)生。
　　 4、在慢性缺氧的心肌組織標(biāo)本中，CUEDC2蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低；在低氧培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，CUEDC2蛋白質(zhì)表達(dá)量也顯著降低，表明CUEDC2在心肌慢性缺氧中可能也發(fā)揮著重要的作用；檢測UPR三個分支的活性后發(fā)現(xiàn)，僅ATF6α分支活性增強(qiáng)，IREα和PERK信號通路的活性無明顯變化；進(jìn)一步在長時間低氧培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中

12、發(fā)現(xiàn)ATF6α的活性升高；干涉ATF6α表達(dá)會導(dǎo)致心肌細(xì)胞在長時間低氧和缺氧復(fù)氧時的凋亡增加，表明ATF6α的活化是心肌慢性缺氧適應(yīng)的重要調(diào)控因子。但是CUEDC2和ATF6之間無相互作用，CUEDC2可能通過其他途徑參與心肌慢性缺氧應(yīng)激。
　　 結(jié)論：
　　 1、CUEDC2在心臟中高表達(dá)，但是敲除CUEDC2基因后不影響小鼠的生長、發(fā)育和生理狀態(tài)下心臟腔室大小和心臟功能；
　　 2、CUEDC2基因敲除能顯著

13、降低缺血再灌注時心肌細(xì)胞的死亡并縮小缺血再灌注時心肌梗死面積；急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時CUEDC2調(diào)節(jié)IRE1-ASK1-JNK信號通路，參與心肌細(xì)胞死亡的發(fā)生：
　　 3、CUEDC2基因敲除不影響心室長時間超負(fù)荷時心肌細(xì)胞肥厚，但是能顯著抑制心功能不全的進(jìn)展；調(diào)節(jié)SERCA2a蛋白穩(wěn)定性和活性是CUEDC2參與心功能不全發(fā)生和進(jìn)展的分子機(jī)制；CUEDC2可能對慢性應(yīng)激時心肌細(xì)胞的功能起負(fù)性調(diào)控作用；
　　 4、慢性缺氧時CU