凋亡在丙烯酰胺亞慢性染毒誘導的中毒性神經病中的初步研究.pdf

1、目的；為闡明凋亡在丙烯酰胺引起的中毒性神經病中的作用，我們建立了大鼠丙烯酰胺亞慢性中毒模型，通過測定大鼠染毒后中樞和周圍神經系統(tǒng)組織中bcl-2、bax和caspase-3表達的變化以及核DNA的改變，探討凋亡相關的分子調控機制在丙烯酰胺毒性機制中的作用，為研究丙烯酰胺誘導的中毒性神經病的發(fā)病機制提供依據。 方法； 1.建立動物模型選用雄性成年Wistar大鼠分別以20mg/kg體重和40mg/kg體重劑量腹腔注射染毒，

2、每周3次，連續(xù)2個月。 2.神經行為指標測定密切觀察各組大鼠一般狀況的變化，每周測量大鼠體重、熱覺傳導、壓痛閾值、后肢撐力、轉棒等指標。 3.神經細胞凋亡的相關檢測 1)形態(tài)學檢測通過對大鼠大腦皮質、小腦和脊髓石蠟切片的HE染色，觀察是否存在細胞凋亡或/和壞死的形態(tài)學變化。 2)TUNEL法檢測通過對大鼠大腦皮質、小腦和脊髓石蠟切片的TUNEL檢測，確定是否存在核DNA的裂解和細胞凋亡的形態(tài)學改變。

3、 3)凋亡相關蛋白和酶的檢測通過免疫組織化學方法測定大腦皮質、小腦和脊髓石蠟切片中Bcl-2和Bax免疫活性的變化；通過Westernblotting測定大腦皮質、小腦、脊髓和坐骨神經中bcl-2、bax和caspase-3表達的變化。 4)DNALadder的檢測測定大腦皮質、小腦和脊髓提取的DNA經瓊脂糖凝膠電泳是否存在DNALadder，來確定是否存在特征性的180～200bp的DNA裂解片段。 結果 1

4、.體重與神經功能測試結果顯示：與對照組相比，中毒后大鼠體重減輕。神經行為學測定結果表明，大鼠熱覺傳導異常(高劑量組時間延長55％，低劑量組縮短39％)，壓痛閾值變小(第3周高劑量組降低45％，第7周低劑量組降低45％)，后肢展開距離明顯加寬(高劑量組增加109％，低劑量組增加59％)，在轉棒上停留的時間縮短(高劑量組縮短98％，低劑量組縮短81％)，都有顯著性差異(P＜0.05)。 2.HE染色結果顯示： 1)大腦皮質：

5、丙烯酰胺染毒組的組織切片并不見細胞數目的減少和細胞壞死的形態(tài)學改變，也無明顯的凋亡，但低劑量組可見核染色質致密濃縮，高劑量組濃縮核進一步增多。 2)小腦：與對照組相比，染毒組小腦切片上浦肯野細胞明顯減少。 3)脊髓腰膨大：正常對照組和染毒組并沒有明顯差異。 3.免疫組化結果顯示： 1)大腦皮質：Bcl-2和Bax的陽性反應物定位在細胞漿，均勻分布，胞核不著色。圖像分析結果表明，與正常對照組相比，陽性細胞B

6、cl-2免疫反應產物的積分光密度低劑量組降低了14％，高劑量組升高了20％，有顯著性差異(P＜0.05)；染毒組Bax免疫反應產物的積分光密度與對照組相比均無顯著性差異。 2)小腦皮質：Bcl-2和Bax蛋白在浦肯野細胞和分子層神經細胞中的染色強度明顯大于顆粒層細胞。圖像分析結果表明：與對照組相比，陽性細胞Bcl-2免疫反應產物的積分光密度低劑量組降低了22％，高劑量組升高了62％，均有顯著性差異(P＜0.01)；Bax免疫反應

7、產物的積分光度與對照組相比，低劑量升高了22％(P＜0.05)，高劑量組降低了30％(P＜0.01)。 3)脊髓腰膨大：圖像分析結果表明：與正常對照組相比，陽性細胞Bcl-2免疫反應產物的積分光密度在低劑量組降低了20％，高劑量組升高了12％，均有顯著性差異(P＜0.05)；Bax免疫反應產物的積分光密度與對照組相比，兩組均無顯著性差異。 4.Westernblotting分析結果顯示： 1)大腦皮質：光密度分析

8、結果表明，bcl-2的表達在低劑量組降低了22％，高劑量組升高了26％，與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)；bax和caspase-3在低、高劑量組的表達與對照組相比無顯著性差異。 2)小腦：與對照組相比，bcl-2的表達在低劑量組降低了25％，高劑量組升高了13％，均有顯著性差異(P＜0.05)；bax的表達在低劑量組升高了14％，高劑量組降低了17％，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)；染毒組caspase-3

9、的表達與對照組相比均無顯著性差異。 3)脊髓：bcl-2的表達與對照組相比均有顯著性差異，低劑量組降低了33％(P＜0.01)，高劑量組升高了25％(P＜0.05)；染毒后bax的表達與對照組相比無顯著性差異；caspase-3在低劑量組的表達增加了41％，高劑量組增加了132％，與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.01)。 4)坐骨神經：與對照組相比，bcl-2的表達在低劑量組增加了104％，高劑量組增加了196％，均

10、有顯著性差異(P＜0.01)；bax的表達在低劑量組增加了49％，高劑量組增加了94％，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)；caspase-3的表達低劑量組增加了8％，高劑量組升高了66％，高劑量組與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。 5.TUNEL檢測結果顯示：光鏡下可見，DNaseⅠ降解處理后陽性對照的大腦皮質、小腦皮質和脊髓中的細胞核呈圓形和不規(guī)則形，棕染，著色深，細胞界限不清。實驗組和陰性對照組切片上細胞核均

11、無著色，表明丙烯酰胺染毒后神經元幾乎沒有DNA的斷裂，沒有3'-OH形成。 6.DNA瓊脂糖電泳結果顯示：大腦皮質、小腦的對照組和脊髓的三個實驗組只出現一條距加樣孔很近的大分子條帶；小腦低劑量染毒組核DNA電泳后可觀察到不典型的DNALadder，高劑量組則可見涂片狀的DNA電泳結果，并可見不明顯的梯狀；染毒組大腦皮質核DNA電泳呈彌散的片狀圖譜，表明丙烯酰胺可引起大腦皮質和小腦神經細胞DNA的損傷。 結論 1.

12、丙烯酰胺亞慢性染毒可引起： 1)大鼠的熱覺傳導異常，痛覺傳導加快，運動神經損傷，運動協(xié)調能力降低。 2)大腦皮質神經細胞核發(fā)生致密濃縮性改變，小腦浦肯野細胞丟失。 3)大腦皮質、小腦和脊髓Bcl-2/Bax改變，低劑量組降低，高劑量組升高。 4)脊髓和坐骨神經中caspase-3表達增加。 5)坐骨神經中bcl-2和bax的表達增加。 6)中樞神經細胞不存在凋亡引起的DNA裂解。