EMT相關(guān)蛋白在大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用及機制.pdf

1、研究背景和目的:
　　 X-連鎖凋亡抑制蛋白相關(guān)因子1(XIAP-associatedFactor1，XAF1)是一個腫瘤抑制基因，能夠直接與內(nèi)源性的XIAP結(jié)合從而逆轉(zhuǎn)其抗caspase的作用，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。FHL2(fourandahalfLIMdomain2)是一個胃腸道癌基因，僅含有四個半的LIM結(jié)構(gòu)域，為數(shù)個信號傳導(dǎo)通路所共有。β-catenin是Wnt通路的關(guān)鍵性分子，能夠與E-cadherin在細(xì)胞膜形成

2、復(fù)合物，對維持細(xì)胞間緊密連接具有重要作用。Snail1和ZEB1(zincfingerE-box-bindinghomeobox1)是E-cadherin的抑制子，同時也是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)的重要轉(zhuǎn)錄因子。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxiainduciablefactor1alpha，HIF-1α)是細(xì)胞適應(yīng)低氧的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可與β-catenin協(xié)同促進(jìn)肝內(nèi)

3、原位侵襲轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并通過與EMT轉(zhuǎn)錄因子(Twist)直接結(jié)合促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。特異性蛋白1（specificityprotein1，Sp1）是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄機制中的重要組分，通過與FHL2啟動子序列結(jié)合對其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。本研究以癌蛋白在大腸癌EMT及侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用及潛在機制為核心，探討上述八個蛋白在胃腸癌中的作用及內(nèi)在聯(lián)系，揭示了大腸癌轉(zhuǎn)移的新的可能機制，為進(jìn)一步的干預(yù)研究提供理論和臨床依據(jù)。
　　 方法:
　

4、　 1、XAF1與FHL2的相互作用
　　 1.1.XAF1相互作用蛋白的篩選及鑒定
　　 克隆人XAF1基因cDNA序列，構(gòu)建pGBKT7-XAF1-DBD酵母表達(dá)載體，以XAF1為“誘餌蛋白”，篩選人卵巢cDNA文庫，利用酵母雙雜交系統(tǒng)尋找XAF1的作用蛋白。運用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白沉淀(GST-pulldown)、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，co-IP)和免疫熒光等技術(shù)進(jìn)一步

5、驗證FHL2為XAF1的作用蛋白，并尋找其功能結(jié)構(gòu)域。
　　 1.2.XAF1對FHL2表達(dá)及功能的作用
　　 分別抽提細(xì)胞總蛋白、胞核、胞漿和線粒體成分蛋白，運用westernblot、co-IP和免疫熒光技術(shù)檢測XAF1對FHL2表達(dá)和分布的影響;雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)和westernblot方法評價XAF1對FHL2共轉(zhuǎn)錄子(β-catenin和AP-1)的活性及下游蛋白(IL-8和p-c-jun)表達(dá)的影響。

6、
　　 2、FHL2在腸癌EMT及侵襲轉(zhuǎn)移中作用及機制
　　 2.1.FHL2在原發(fā)性腸癌和轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)
　　 運用免疫組織化學(xué)方法（immunohistochemistry,IHC）觀察17對原發(fā)和轉(zhuǎn)移腸癌組織中FHL2的表達(dá)和分布，探討其與腸癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　 2.2.FHL2對腸癌細(xì)胞粘附和侵襲轉(zhuǎn)移的作用
　　 實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)(real-timequant

7、itativePCR，qPCR)評價不同粘附能力細(xì)胞群中FHL2的表達(dá)水平。粘附、侵襲和劃痕實驗分別評價FHL2對腸癌細(xì)胞粘附和侵襲轉(zhuǎn)移能力的作用。
　　 2.3.FHL2對EMT的作用
　　 重組轉(zhuǎn)化生長因子-beta1(Recombinanthumantransforminggrowthfactorbeta1，rTGF-β1)和/或抗TGF-β1抗體處理不同F(xiàn)HL2表達(dá)水平的腸癌細(xì)胞，RT-PCR、qPCR和west

8、ernblot評價FHL2對rTGF-β1誘導(dǎo)的EMT的作用。
　　 運用siRNA敲低和同義基因過表達(dá)以及過表達(dá)截短突變蛋白拮抗內(nèi)源蛋白等方法改變FHL2的表達(dá)，觀察FHL2單獨對EMT標(biāo)志分子的作用。
　　 2.4.FHL2促進(jìn)腸癌EMT的機制
　　 Westernblot、IHC、雙熒光素酶實驗等分別探討FHL2與E-cadherin，F(xiàn)HL2與β-catenin的相關(guān)關(guān)系;免疫熒光技術(shù)觀察FHL2對胞膜E

9、-cadherin/β-catenin復(fù)合物形成的影響。
　　 3、FHL2通過與Snail1結(jié)合抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)
　　 3.1.FHL2與Snail1在腸癌的表達(dá)
　　 Westernblot、免疫熒光雙標(biāo)記和IHC分別檢測FHL2與Snail1在腸癌細(xì)胞及臨床原發(fā)腸癌及轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)。
　　 3.2.FHL2與Snail1的相互作用及功能性結(jié)構(gòu)域的鑒定
　　 Co-IP檢

10、測內(nèi)、外源性FHL2和Snail1的作用;并進(jìn)一步明確FHL2-Snail1結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。
　　 3.3.FHL2對Snail1表達(dá)及代謝的作用
　　 分別抽提細(xì)胞總蛋白及胞核、胞漿蛋白，westernblot檢測FHL2過表達(dá)對Snail1總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)的作用。
　　 3.4.FHL2通過結(jié)合Snail1對E-cadherin發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用
　　 構(gòu)建不同長度E-cadherin啟動子片段（含

11、Snail1結(jié)合位點）的野生型及突變型熒光素酶報告基因質(zhì)粒，評價FHL2對E-cadherin轉(zhuǎn)錄活性的影響。聯(lián)合實驗評價Snail1低表達(dá)對FHL2過表達(dá)抑制E-cadherin啟動子轉(zhuǎn)錄活性的作用。
　　 4、HIF-1α在腸癌EMT及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機制
　　 4.1.HIF-1α對細(xì)胞形態(tài)及EMT標(biāo)志性分子的作用
　　 通過甲磺酸去鐵胺（deferoxaminemesylatesalt，DFO）刺激誘導(dǎo)

12、，和Ad5-HIF-1α-EGFP病毒感染兩種方法獲得HIF-1α過表達(dá)的細(xì)胞。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化以及E-cadherin和Vimentin的分布;并探討HIF-1α對EMT標(biāo)志性分子E-cadherin，Plakoglobin，Vimentin和N-cadherin的作用。
　　 4.2.體外HIF-1α對腸癌細(xì)胞粘附、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響
　　 DFO(100μM)或Ad5-HIF-1α-EGFP(MOI=10

13、0)感染細(xì)胞后，分別運用粘附、侵襲和劃痕實驗檢測HIF-1α對腸癌細(xì)胞粘附、侵襲轉(zhuǎn)移能力的作用。
　　 4.3.體內(nèi)HIF-1α對腸癌細(xì)胞侵襲侵襲能力的影響
　　 構(gòu)建腺病毒重組質(zhì)粒pDC316-HIF-1α-EGFP。采用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)進(jìn)行包裝并獲得高滴度濃縮液。將Ad5-HIF-1α-EGFP和Ad5-EGFP分別感染的HT29單細(xì)胞懸液（1.2X106/只）脾被膜下注射于5～6周齡BALB/c雌性裸鼠。3

14、6天后處死、解剖，首先肉眼觀察有無脾臟原位瘤的發(fā)生;是否存在肝、肺、腎等臟器轉(zhuǎn)移。取肝脾保存，后續(xù)H&E，IHC及其他實驗待用。
　　 4.4.HIF-1α促進(jìn)腸癌EMT的機制
　　 QPCR和IHC檢測HIF-1α和ZEB1在同一病人癌旁正常粘膜和腸癌組織的表達(dá)情況;IHC觀察HIF-1α、ZEB1、E-cadherin和Vimentin在22對同一病人的原發(fā)腸癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá);qPCR和westernblo

15、t觀察DFO或腺病毒感染對ZEB1的作用;生物信息學(xué)分析ZEB1啟動子上游3500nt內(nèi)（定義翻譯起始密碼子ATG為0）潛在的HIF-1α結(jié)合位點(hypoxiaresponseelement,HRE);電泳遷移率變動分析（ElectrophoresisMobilityShiftAssay，EMSA）檢測核蛋白與探針的結(jié)合反應(yīng)，尋找HIF-1α與ZEB1直接結(jié)合的證據(jù)。
　　 5、Sp1在腸癌干細(xì)胞(cancerstemcell

16、s，CSCs)中的作用
　　 5.1.腸癌CSCs的分離、純化和培養(yǎng)
　　 運用Ficoll-Paque密度梯度法，收集Ficoll-Paque和培養(yǎng)基中間層細(xì)胞，即CSCs。培養(yǎng)條件如下:含10ng/ml重組人成纖維細(xì)胞生長因子(recombinanthumanfibroblastgrowthfactor-basic，F(xiàn)GF-2)，20ng/ml重組人表皮生長因子(recombinanthumanepidermalgr

17、owthfactor,EGF),0.2％N-2PlusmediaSupplement，100μg/mL鏈霉素和100U/mL青霉素的Dulbecco'sModifiedEagleMedia:NutrientMixtureF12，(DMEM/F12)培養(yǎng)基;低粘附能力培養(yǎng)皿;37℃、5％CO2、98％-100％濕度常規(guī)培養(yǎng)。
　　 5.2.CSCs特性、EMT及干細(xì)胞表面標(biāo)志分子的鑒定
　　 顯微鏡下觀察干細(xì)胞球的形成;流

18、式細(xì)胞分析技術(shù)評價靜止期干細(xì)胞的比例;Ki-67免疫染色觀察增殖速度;qPCR檢測Snail、E-cadherin、Vimentin、CD117(c-Kit)在CSCs和對照細(xì)胞中的表達(dá);qPCR和流式細(xì)胞技術(shù)檢測CD133、CD44和CD166的表達(dá)。
　　 5.3.Sp1在腸癌組織及CSCs中的表達(dá)
　　 IHC觀察45對腸癌組織和癌旁腸粘膜Sp1的表達(dá)情況。qPCR和westernblot檢測Sp1在腸癌CSCs及

19、對照中的表達(dá)。
　　 5.4.Sp1對CSCs生長，克隆形成及凋亡的影響
　　 轉(zhuǎn)染Sp1siRNA/CtrlsiRNA，或500nM光輝霉素(MithramycinA，MIA)/PBS處理分別至CSCs。顯微鏡下計數(shù)不同時間點活細(xì)胞數(shù)，評價Sp1低表達(dá)對CSCs生長的作用;soft-agar實驗評價Sp1對細(xì)胞克隆球形成能力的作用;流式細(xì)胞技術(shù)評估抑制Sp1表達(dá)對CSCs凋亡的影響。
　　 5.5.體內(nèi)、體外S

20、p1低表達(dá)對CD44和CD166表達(dá)的作用
　　 5-6周齡雌性BALB/c裸鼠皮下接種SW480或HCT116單細(xì)胞懸液，瘤體可觸時，腹腔注射MIA或PBS，每3天一次，連續(xù)3周，并測量瘤體體積。3周后處死并取出瘤體，膠原酶消化，對單細(xì)胞懸液進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)檢測，評價Sp1低表達(dá)對CD44和CD166表達(dá)的影響。
　　 轉(zhuǎn)染Sp1siRNA/CtrlsiRNA到CSCs，或進(jìn)行MIA處理。qPCR和流式細(xì)胞技術(shù)檢測CD

21、44和CD166的表達(dá)。
　　 6、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理
　　 IHC每張切片隨機選取3-5個不同視野，計算目的蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)率，并進(jìn)行兩個樣本的配對t檢驗;qPCR，細(xì)胞粘附、侵襲、生長、克隆形成以及雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果先進(jìn)行方差齊性檢驗，方差齊(P＞0.05)則進(jìn)行兩個處理組間獨立樣本t檢驗或多個處理組間onewayANOVA統(tǒng)計分析，整體比較有顯著性差異后多重比較采用LSD法;方差不齊(P＜0.05)則應(yīng)用Sa

22、tterthwaite近似t檢驗或Welch檢驗分析，整體比較有顯著性差異后多重比較采用Dunnett'sT3檢驗。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，P＜0.05具有顯著性差異。
　　 結(jié)果:
　　 1、XAF1能夠與FHL2結(jié)合并消減其表達(dá)和功能
　　 1.1.XAF1作用蛋白的篩選及鑒定
　　 以XAF1為“誘餌蛋白”，篩選人卵巢cDNA文庫，挑出22個

23、陽性克隆抽提酵母質(zhì)粒進(jìn)行測序分析鑒定，經(jīng)NCBIGenebank數(shù)據(jù)庫BLAST比對證實，其中兩個克隆為FHL2基因部分片段（包含598個堿基）。GST-pulldown、co-IP和免疫熒光共定位等技術(shù)證實FHL2為XAF1結(jié)合蛋白。
　　 1.2.FHL2與XAF1作用結(jié)構(gòu)域的鑒定
　　 FHL2的第二個LIM結(jié)構(gòu)域(LIM2)介導(dǎo)FHL2-XAF1結(jié)合過程，并起負(fù)性調(diào)控作用;LIM3和LIM4參與上述作用;而XAF

24、1的N端鋅指結(jié)構(gòu)和C端非鋅指結(jié)構(gòu)均能夠結(jié)合FHL2。
　　 1.3.XAF1對FHL2表達(dá)及分布的作用
　　 FHL2和XAF1在細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞漿均有表達(dá)，且兩蛋白在上述三部位均有相互作用;XAF1負(fù)性調(diào)控FHL2總蛋白的表達(dá)，降低FHL2在細(xì)胞核和漿的表達(dá)水平，但增加線粒體的FHL2表達(dá)水平。
　　 1.4.XAF1對FHL2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活性作用的檢測
　　 XAF1過表達(dá)顯著抑制pTOPFLAS

25、H轉(zhuǎn)錄活性，其相對熒光值在AGS-vector細(xì)胞為476.85±30.65，而在AGS-XAF1為267.20±0.48(P=0.000)。相反，抑制XAF1表達(dá)增加pTOPFLASH轉(zhuǎn)錄活性，其相對熒光值在ctrlsiRNA組為309.67±31.94，而在XAF1siRNA組為752.13±108.97(P=0.003);同理，XAF1過表達(dá)抑制、而XAF1siRNA增加Luc/AP1的轉(zhuǎn)錄活性。在AGS/vector為122.2

26、1±3.31，而在AGS/XAF1為71.06±6.92(P=0.000);相反，ctrlsiRNA組為110.30±30.36，而XAF1siRNA組為250.07±33.94(P=0.006)。Westernblot結(jié)果顯示XAF1同樣負(fù)性調(diào)控TCF/β-catenin的下游基因IL-8以及p-c-jun的蛋白表達(dá)。
　　 2、FHL2通過調(diào)控E-cadherin/β-catenin復(fù)合物的形成促進(jìn)腸癌的EMT及侵襲轉(zhuǎn)移

27、r>　　 2.1.FHL2在原發(fā)腸癌及轉(zhuǎn)移癌中高表達(dá)
　　 FHL2在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于鄰近正常腸粘膜，上皮性腫瘤細(xì)胞占主導(dǎo)，且胞核、胞漿均有表達(dá)，而癌周正常組織間質(zhì)無表達(dá);FHL2在轉(zhuǎn)移癌也呈強陽性表達(dá)，陽性率與原發(fā)灶相當(dāng)(P=0.365)。FHL2還能夠穿透基底膜進(jìn)入基底膜下的間質(zhì)區(qū)域，提示FHL2與腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　 2.2.FHL2對腸癌細(xì)胞粘附、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響
　　 高粘附能力細(xì)胞中

28、FHL2的表達(dá)高于低粘附能力細(xì)胞;siRNA壓低FHL2表達(dá)后細(xì)胞的黏附能力降低;侵襲和劃痕實驗表明FHL2表達(dá)水平與腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)關(guān)系。
　　 2.3.FHL2與rTGF-β1及rTGF-β1誘導(dǎo)的EMT的關(guān)系
　　 rTGF-β1能夠以劑量依賴方式刺激FHL2的表達(dá)，降低E-cadherin而增加Vimentin的表達(dá);TGF-β1中和抗體不僅抑制內(nèi)源性FHL2的表達(dá)，而且可以阻斷外源性rTGF-β1

29、引起的FHL2表達(dá);FHL2siRNA阻斷了rTGF-β1引起的Vimentin表達(dá)，而增加E-cadherin表達(dá)。在FHL2過表達(dá)細(xì)胞中，抑制Smad2/3或Smad4的表達(dá)對E-cadherin和Vimentin表達(dá)水平無影響。
　　 2.4.FHL2對多個EMT標(biāo)志性分子的作用
　　 FHL2與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;與Vimentin、MMP-9、Snail和Twist呈正相關(guān)關(guān)系。
　　 2

30、.5.FHL2與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)關(guān)系
　　 FHL2在腸癌組織表達(dá)水平顯著高于鄰近正常腸粘膜;而E-cadherin在癌旁正常組織高于腸癌組織。細(xì)胞模型上，F(xiàn)HL2陰性調(diào)控E-cadherin的表達(dá)。
　　 2.6.FHL2與β-catenin呈正相關(guān)關(guān)系
　　 FHL2表達(dá)的變化對β-catenin總蛋白的表達(dá)無明顯影響，而磷酸化β-catenin與FHL2呈反向關(guān)系;FHL2高表達(dá)降低細(xì)胞漿和核的

31、磷酸化β-catenin;FHL2正向調(diào)控β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，DLD1-pcDNA3.1中pTOPFLASH/pFOPFLASH比值為15.10±1.75，而DLD1-FHL2-pcDNA3.1中增加到30.10±4.47(P=0.006)。相反，上述比值在SW480FHL2siRNA中為1.47±0.65，而在對照細(xì)胞為21.82±11.31(P=0.036)。此外，壓低FHL2表達(dá)能夠降低β-catenin下游靶基因——S

32、urvivin和CyclinD1的核酸和蛋白表達(dá)水平。
　　 2.7.FHL2對E-cadherin/β-catenin復(fù)合物形成的影響
　　 siRNA壓低FHL2表達(dá)后，E-cadherin和β-catenin由胞核分布為主轉(zhuǎn)為胞膜分布為主;而高表達(dá)FHL2導(dǎo)致膜相關(guān)性E-cadherin和β-catenin減少，核蛋白表達(dá)增加。
　　 3、FHL2通過與Snail1結(jié)合抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)<

33、br>　　 3.1.FHL2和Snail1在腸癌的表達(dá)及分布
　　 FHL2在SW480，HCT15和SW1116中高表達(dá)，Snail在上述三株細(xì)胞系表達(dá)水平也較高;FHL2在DLD1和HT29中表達(dá)相對較低，同樣，Snail在該兩株細(xì)胞也呈低表達(dá)甚至不表達(dá)。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)FHL2和Snail在細(xì)胞漿和核均有分布，且都以核為主。FHL2和Snail1在臨床組織中表達(dá)譜亦相似，在原發(fā)腸癌和轉(zhuǎn)移癌中均呈強陽性表達(dá)，而鄰近正常

34、組織表達(dá)較低，且具有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 3.2.FHL2能夠與Snail1結(jié)合
　　 Co-IP發(fā)現(xiàn)FHL2能夠與Snail1結(jié)合，且只有表達(dá)FHL2完整蛋白的細(xì)胞沉淀物中能夠檢測到Snail1，而任何LIM結(jié)構(gòu)域的缺失均不能，提示FHL2基因的完整性為FHL2-Snail1相互作用所必需。
　　 3.3.FHL2對Snail1總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)的作用
　　 首先驗證了FHL2對

35、E-cadherin的負(fù)性調(diào)控作用，并發(fā)現(xiàn)FHL2高表達(dá)增加Snail1總蛋白而降低磷酸化Snail表達(dá)，同時Snail1負(fù)性調(diào)控E-cadherin。
　　 3.4.FHL2通過結(jié)合Snail1對E-cadherin發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用
　　 Westernblot和雙熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn):抑制FHL2表達(dá)能夠降低Snail蛋白的表達(dá)水平，同時增加E-cadherin的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄活性。FHL2過表達(dá)抑制E-cadherin

36、轉(zhuǎn)錄活性，pLuc232在對照細(xì)胞中RLU值為176.03±26.15，而在DLD1-FHL2-pcDNA3.1降低為100.40±7.47(P=0.009);同樣，pLuc601在對照細(xì)胞為102.65±10.27，而在DLD1-FHL2-pcDNA3.1降低為68.08±7.93(P=0.010)。pLuc232-wt在對照siRNA及FHL2siRNA處理組相對熒光值為76.36±18.32和147.61±16.63(P=0.03

37、3);pLuc601-wt則分別為61.80±12.99和84.30±8.90(P=0.018)。將Snail與E-cadherin結(jié)合元件E-box定點突變能夠增加E-cadherin轉(zhuǎn)錄活性，且該作用在pLuc232較為顯著，pLuc232-wt組為76.36±18.32，而pLuc232-mt組為128.84±6.92(P=0.033)。最后，聯(lián)合實驗發(fā)現(xiàn):抑制Snail表達(dá)后，pLuc232-mt/pLuc232-wt比值增加，

38、且FHL2能夠放大上述E-box突變對E-cadherin轉(zhuǎn)錄活性的增加作用。
　　 4、HIF-1α通過調(diào)控ZEB1促進(jìn)腸癌EMT及侵襲轉(zhuǎn)移能力
　　 4.1.HIF-1α對細(xì)胞形態(tài)及EMT標(biāo)志性分子表達(dá)的作用
　　 DFO及Ad5-HIF-1α-EGFP處理細(xì)胞后，HIF-1αmRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加，并引起細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化。對照細(xì)胞呈圓形、橢圓形等多種上皮細(xì)胞樣形態(tài)，且細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞極性

39、良好;而DFO誘導(dǎo)、HIF-1α過表達(dá)的細(xì)胞呈梭形、成纖維細(xì)胞狀，同時細(xì)胞間隙增寬。缺氧或HIF-1α能夠抑制E-cadherin和Plakoglobin、促進(jìn)Vimentin和N-cadherin的表達(dá);E-cadherin主要分布在未處理細(xì)胞的胞膜，尤其細(xì)胞連接處;而DFO處理誘導(dǎo)E-cadherin由胞膜向胞漿和核內(nèi)移位，同時增加Vimentin的表達(dá)水平。
　　 4.2.體外HIF-1α對腸癌細(xì)胞粘附、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

40、
　　 HIF-1α在高粘附能力細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于低粘附能力細(xì)胞(P＜0.05);DFO處理和腺病毒感染能夠顯著增加腸癌細(xì)胞的粘附、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。
　　 4.3.體內(nèi)HIF-1α對腸癌細(xì)胞侵襲侵襲能力的影響
　　 腸癌裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗發(fā)現(xiàn)，接種腺病毒感染的HT29細(xì)胞后，裸鼠飲食和精神狀態(tài)等一般情況無明顯改變。解剖后肉眼發(fā)現(xiàn)20只裸鼠均無脾臟原位瘤的發(fā)生，亦無肺、腎等臟器轉(zhuǎn)移。HT29-Ad5-EGFP組有1

41、只形成肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶(1/8)、2只大面積、甚至整個肝臟發(fā)生明顯斑點狀缺血、壞死(2/8);HT29-Ad5-HIF-1α-EGFP組3只肝臟缺血壞死(3/12);8只形成肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶(8/12)，且轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目明顯多于對照組;上述發(fā)生肝缺血壞死的裸鼠其脾臟明顯充血，體積較大。
　　 4.4.HIF-1α和ZEB1在腸癌組織的表達(dá)
　　 HIF-1α和ZEB1在腸癌組織中表達(dá)水平均顯著高于鄰近正常腸組織，且主要分布在癌細(xì)胞胞核

42、，胞漿亦有少量分布。qPCR顯示類似的結(jié)果。
　　 4.5.HIF-1α正性調(diào)控ZEB1的表達(dá)
　　 ZEB1的表達(dá)水平隨HIF-1α的升高而升高。
　　 4.6.HIF-1α蛋白通過HRE3序列結(jié)合ZEB1啟動子
　　 生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):在ZEB1啟動子3500nt內(nèi)(定義翻譯起始密碼子ATG為0，轉(zhuǎn)錄起始位點TSS距ATG為22nt)存在4處HRE位點:分別位于-517～-521bp(HRE1),-

43、525～-529bp(HRE2),-630～-634bp(HRE3)和-1342～-1347bp(HRE4)。EMSA結(jié)果發(fā)現(xiàn):未加核蛋白組無條帶出現(xiàn);HIF-1α過表達(dá)+野生型探針組均有結(jié)合條帶出現(xiàn)，突變上述4個核心序列后，僅在包含HRE3突變序列探針組條帶消失。
　　 4.7.HIF-1α，ZEB1，E-cadherin和Vimentin在原發(fā)腸癌和轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)
　　 HIF-1α和ZEB1在原發(fā)腸癌和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)

44、呈陽性表達(dá)，且主要分布在腸癌細(xì)胞核和漿;Vimentin主要分布在原發(fā)腸癌和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的間質(zhì)。E-cadherin在腸癌細(xì)胞膜、漿和核均有分布，胞膜尤甚，而在淋巴結(jié)幾乎無表達(dá)。HIF-1α、ZEB1和Vimentin在轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)高于原發(fā)腸癌組織，其中HIF-1α和ZEB1具有顯著性差異(P＜0.05);而Vimentin無顯著性差異(P=0.203)。E-cadherin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達(dá)顯著低于原發(fā)腸癌組織(P=0.000

45、)。
　　 5、Sp1在腸癌CSCs中的作用
　　 5.1.腸癌CSCs的分離及鑒定
　　 Ficoll-Paque密度梯度法能夠成功分離出具有典型CSCs特性的細(xì)胞球，為懸浮、圓或不規(guī)則圓形，邊界清晰;處于靜止期的細(xì)胞比例較對照組明顯增加(34.88％vs7.11％)。在SW480細(xì)胞，Ki67+細(xì)胞比例為87.06％，而在SW480-CSCs為12.29％(P=0.000);同樣，HCT116和HCT116-

46、CSCs分別為94％和9.9％(P=0.000)，提示CSCs增殖較慢。
　　 5.2.腸癌CSCs獲得EMT特性
　　 Snail和Vimentin在腸癌CSCs的表達(dá)水平顯著高于對照細(xì)胞(P＜0.05);c-kit在SW480或HCT116表達(dá)水平很低，甚至檢測不出，而在CSCs中表達(dá)顯著增加(P＜0.05);E-cadherin在CSCs的表達(dá)水平顯著低于對照細(xì)胞(P＜0.05)。
　　 5.3.腸癌CSC

47、s表面標(biāo)志分子的表達(dá)
　　 CD44在SW480，DLD1，HCT116，HT-29，HCT15，LoVo和SW1116細(xì)胞均有表達(dá);CD166表達(dá)譜與CD44類似（LoVo細(xì)胞除外）;然而，CD133在上述7個細(xì)胞系中表達(dá)水平均較低，甚至無表達(dá);CD133、CD44和CD166在SW480及HCT116來源的CSCs中表達(dá)均較對照細(xì)胞顯著增加(P＜0.05)，但CD44和CD166的表達(dá)比CD133更具有代表性。流式細(xì)胞技術(shù)顯

48、示:SW480-CSCs中CD44+CD166+細(xì)胞比例為25.89％，對照細(xì)胞為6.55％;HCT116-CSCs中CD44+CD166+細(xì)胞比例為18.63％，而對照細(xì)胞為4.56％。
　　 5.4.Sp1在腸癌組織及腸癌CSCs中的表達(dá)
　　 Sp1陽性染色定位于腸癌細(xì)胞胞核;癌旁腸粘膜表達(dá)水平較低，甚至無表達(dá);在鄰近正常腸粘膜，57.8％的細(xì)胞為Sp1陰性表達(dá)，僅5.9％為Sp1強陽性表達(dá);而在腸癌組織，Sp1陰

49、性細(xì)胞占25.2％，陽性細(xì)胞達(dá)74.8％(10.4％:+;34.1％:++;30.3％:+++);Sp1在CSCs中的mRNA和蛋白水平均顯著高于對照細(xì)胞;Sp1在正常腸粘膜、腸癌及腸癌CSCs中的表達(dá)呈遞增趨勢。
　　 5.5.Sp1對CSCs生長，克隆形成及凋亡的影響
　　 Sp1siRNA和MIA抑制Sp1表達(dá)后顯著阻礙CSCs的生長(27％vs79.95％和14.41％vs78.42％）。與ctrlsiRNA組相

50、比，轉(zhuǎn)染Sp1siRNA組細(xì)胞克隆數(shù)減少約91.7％(P=0.000);類似地，MIA處理后，細(xì)胞克隆數(shù)被抑制到4.65％(P=0.000)。CtrlsiRNA組發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例為8.75％，而Sp1siRNA組增加為52.69％;同樣，PBS組為4.89％，而MIA處理組增加為55.59％。
　　 5.6.體內(nèi)Sp1低表達(dá)對裸鼠皮下成瘤及CD44和CD166表達(dá)的影響
　　 SW480成瘤組，PBS注射組CD44+C

51、D166+細(xì)胞比例為18.02％，而MIA處理后減少至2.14％;HCT116成瘤對照組CD44+CD166+細(xì)胞占23.6％，而MIA處理后降低為2.9％。HCT116成瘤組，MIA對CD44+細(xì)胞由7.53％抑制為1.11％;而對CD166+細(xì)胞僅由18.03％降為16.18％。
　　 5.7.體外Sp1低表達(dá)對CD44和CD166表達(dá)的影響
　　 隨著Sp1表達(dá)的降低，CD44和CD166表達(dá)亦顯著降低(P＜0.0

52、5);另一方面，隨MIA劑量的增加，CD44和CD166表達(dá)量遞減。流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示:Sp1siRNA轉(zhuǎn)染組CD44+CD166+細(xì)胞比例由對照組的32.05％降低為6.77％;MIA組由20.08％降為0.93％。
　　 結(jié)論:
　　 1、FHL2是一個XAF1結(jié)合蛋白;XAF1負(fù)性調(diào)控FHL2的活性和表達(dá)。
　　 2、FHL2通過調(diào)控E-cadherin/β-catenin復(fù)合物的形成促進(jìn)腸癌的EMT及侵

53、襲轉(zhuǎn)移。
　　 3、FHL2通過與Snail1結(jié)合抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
　　 4、HIF-1α通過調(diào)控ZEB1促進(jìn)腸癌EMT及侵襲轉(zhuǎn)移的能力。
　　 5、抑制Sp1的表達(dá)削弱了腸癌CSCs特性。
　　 6、XAF1和E-cadherin在胃腸癌扮演抑癌基因角色，而FHL2、β-catenin、Snail1、HIF-1α和ZEB1為癌基因，在大腸癌EMT及侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要意義。本研究揭示

54、了大腸癌轉(zhuǎn)移的新的可能機制，為進(jìn)一步的干預(yù)研究提供理論和臨床依據(jù)。
　　 本研究的創(chuàng)新之處
　　 1、利用酵母雙雜交系統(tǒng)、GST-pulldown、co-IP和免疫熒光共定位等方法，篩選并鑒定出FHL2為XAF1的作用蛋白，為研究胃腸癌發(fā)生發(fā)展的信號通路機制提供新思路。
　　 2、首次報道抑癌基因(XAF1)與癌基因(FHL2)在胃癌中的相互作用。
　　 3、首次揭示FHL2在腸癌EMT及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用