茶多酚EGCG在大腸癌預(yù)防中的作用及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景： 近年來隨著人們生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變，大腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨 勢(shì)。雖然對(duì)大腸癌治療的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，但始終不能改變其發(fā)病率高 死亡率高的特點(diǎn)，對(duì)患者預(yù)后亦無明顯改善，因此大腸癌相關(guān)預(yù)防一直是近年來 研究的熱點(diǎn)。對(duì)大腸癌發(fā)病機(jī)制的深入闡明，也使我們有可能在基因水平上進(jìn)行 檢測(cè)和干預(yù)。有研究表明常食用油炸食品與大腸癌的發(fā)病有重要聯(lián)系，這與高蛋 白食物經(jīng)油炸后產(chǎn)生具有明顯致癌、致突變作用的熱裂解產(chǎn)物

2、一雜環(huán)胺類物質(zhì)有 關(guān)，其中2-氨基3’甲基咪唑。(4，5-f喹啉(IQ)是含量相對(duì)較多的一種。因?yàn)?IQ廣泛存在于食品中難以完全去除，所以化學(xué)預(yù)防是防范其潛在健康危害的重 要手段。有研究顯示結(jié)腸上皮在雜環(huán)胺代謝中可能起到關(guān)鍵的拓用。 植物化學(xué)保護(hù)劑預(yù)防腫瘤發(fā)生機(jī)制相關(guān)研究是目前的熱點(diǎn)。茶葉是人類最常飲用的健康飲料之一，含有多種抗腫瘤成份，提取物茶多酚中的EGcG被認(rèn)為抑制腫瘤生長(zhǎng)效應(yīng)最強(qiáng)。目前關(guān)于EGCG作用的研究主要集中

3、于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換和啟動(dòng)凋亡通路兩個(gè)方面，但確切的抗癌機(jī)制尚不十分清楚。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)是物質(zhì)代謝II相酶中重要的一員，可催化致癌物與葡萄糖醛酸結(jié)合，加速其排泄。已有研究表明UGTlA同工酶家族可被多種物質(zhì)誘導(dǎo)起到潛在的抗癌作用，包括類黃酮類、姜黃素、萊菔子素等。Nrf2基因是鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，近年的研究發(fā)現(xiàn)Nrf2與代謝酶的誘導(dǎo)有關(guān)。人類大腸呈現(xiàn)出復(fù)雜的UGTlA基因位點(diǎn)表達(dá)模式，從人腸道中擴(kuò)增出的U

4、GTlA8和uGTlA10基因全長(zhǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞體外研究發(fā)現(xiàn)，二者在致癌物代謝中起重要作用，并具有組織特異性，主要分布于結(jié)腸，胃腸道葡萄糖醛酸酶酸化反應(yīng)是肝臟解毒反應(yīng)的補(bǔ)充。我們的初步研究結(jié)果與Giuliani等的研究相符，即在大腸癌組織中這兩種酶活性降低，可能為大腸癌發(fā)病機(jī)制之一。因此研究誘導(dǎo)UGTlA8和UGTlA1O基因表達(dá)的機(jī)制對(duì)預(yù)防大腸癌意義重大。 本研究選擇茶多酚EGCG作用于基礎(chǔ)UGT酶表達(dá)存在明顯差異的兩種結(jié)腸癌細(xì)胞系

5、Caco-2和HT-29，研究EGCG誘導(dǎo)UGTlA及其同工酶UGTlA8、UGTlA10表達(dá)過程中的Nrf2相關(guān)機(jī)制；并在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)一步探討EGCG能否對(duì)致癌物IQ引起的大腸粘膜隱窩畸變起到保護(hù)作用，分析大腸粘膜UGTlA基因表達(dá)的變化及二者之間的關(guān)系。 目的： 1．體外分析EGCG對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞毒性作用的濃度依賴效應(yīng)，探討不同濃度EGCG可能的作用機(jī)制，篩選適宜的EGCG作用濃度進(jìn)一步分析其誘導(dǎo)UGTlA酶表達(dá)的作用，

6、初步探討Nrf2基因在EGCG誘導(dǎo)UGTlA酶表達(dá)過程中的作用。 2．體外封閉結(jié)腸癌細(xì)胞中Nrf2基因的表達(dá)，觀察EGCG誘導(dǎo)UGTlA酶表達(dá)作用的變化，反向驗(yàn)證Nrf2基因在這一過程中的重要作用。 3．動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察EGCG對(duì)IQ所致小鼠大腸畸變隱窩灶(ACF)形成的影響，分析小鼠大腸粘膜Nrf2、UGTlA基因及凋亡相關(guān)Bax基因表達(dá)的變化，探討EGCG預(yù)防大腸癌的可能機(jī)制。 結(jié)論： 1．茶多酚EG

7、CG通過多種機(jī)制干預(yù)體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。較高濃度時(shí)通過Bcl-2/Bax相關(guān)途徑誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，低濃度時(shí)可誘導(dǎo)代謝酶基因的表達(dá)。2．茶多酚EGCG可上調(diào)Nrf2基因表達(dá)，并誘導(dǎo)Ⅱ相代謝酶UGTlA及其腸道專有同工酶UGTlA8、UGTlA10的表達(dá)。 3．Nrf2基因在EGCG誘導(dǎo)UGTlA及其同工酶UGTlA8、UGTlA10的表達(dá)過程中起重要作用，封閉Nrf2基因可阻斷EGCG對(duì)UGTlA酶的誘導(dǎo)作用。 4

8、．pSilencer3.1-H1 neo質(zhì)粒介導(dǎo)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染RNA干擾體系能夠有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2及HT-29中靶基因的表達(dá)。 5．針對(duì)Nrf2 mRNA序列204-222 bp位置設(shè)計(jì)并構(gòu)建的RNA干擾重組載體pSilence-Nrf2-B 能夠有效抑制靶基因的表達(dá)，抑制率達(dá)80％以上。 6．Caco-2-siNrf2和HT-29-siNrf2細(xì)胞為成功構(gòu)建的低表達(dá)Nrf2基因的結(jié)腸癌細(xì)胞系，可用于Nrf2及

9、相關(guān)基因功能分析的研究。 7．茶多酚EGCG能夠抑制IQ誘導(dǎo)的小鼠大腸畸變隱窩灶的形成，進(jìn)而預(yù)防大腸癌的發(fā)生，這種作用可能主要是通過誘導(dǎo)Nrf2及UGTlA基因的表達(dá)，從而增加腸粘膜對(duì)致癌物IQ的代謝，減少IQ所致ACF的數(shù)量來實(shí)現(xiàn)。 意義： 1．本研究體外實(shí)驗(yàn)中，驗(yàn)證了高濃度EGCG通過誘導(dǎo)凋亡抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制，并率先提出了低濃度EGCG可通過上調(diào)Nrf2基因誘導(dǎo)Ⅱ相代謝酶UGTlA、lA8

10、1A10的表達(dá)來千預(yù)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的新機(jī)制。 2．本研究利用RNA干擾技術(shù)封閉Nrf2基因的表達(dá)，建立低表達(dá)Nrf2基因的結(jié)腸細(xì)胞系，正、反向兩方面證實(shí)Nrf2基因在EGCG誘導(dǎo)UGTlA、1A8及IA10基因表達(dá)中的重要作用，為研究Nrf2基因參與代謝酶誘導(dǎo)的機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 3．本研究證實(shí)RNA干擾技術(shù)可以應(yīng)用于大腸癌化學(xué)預(yù)防的研究。 4．應(yīng)用致癌物IQ誘發(fā)小鼠大腸粘膜隱窩畸變，構(gòu)建用于評(píng)價(jià)大腸癌化