白藜蘆醇抑制Raji細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　 淋巴瘤起源于淋巴結(jié)和淋巴組織，其發(fā)生大多與免疫應(yīng)答過(guò)程中淋巴細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生的某種免疫細(xì)胞惡變有關(guān)，是免疫系統(tǒng)的惡性腫瘤。按組織病理學(xué)改變，淋巴瘤可分為霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkinlymphoma，NHL)。非霍奇金淋巴瘤是血液系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，其病死率高，傳統(tǒng)化療副作用大，患者多不能長(zhǎng)期堅(jiān)持，且復(fù)發(fā)率高；造血干細(xì)胞移植費(fèi)用較高，資源有限，限制了其

2、在臨床的廣泛應(yīng)用。因此新型的低副作用的抗腫瘤藥日漸受到人們關(guān)注。
　　 熱休克蛋白(HSPs)是早在1962年就被發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的蛋白，不同情況的應(yīng)激均能誘導(dǎo)它。隨后人們又發(fā)現(xiàn)HSPs可以作為其他細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分子伴侶，對(duì)后者有很好的保護(hù)作用。在HSP家族中最重要、誘導(dǎo)后表達(dá)量最大的是HSP70家族，為廣泛分布在細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的可溶性蛋白。HSP70通過(guò)與其客戶蛋白質(zhì)的結(jié)合或減弱或增強(qiáng)蛋白質(zhì)活性，以應(yīng)付外界壓力。HSP7

3、0在正常細(xì)胞中不表達(dá)或表達(dá)量很低，但在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。大量實(shí)驗(yàn)表明，熱休克蛋白能通過(guò)其分子伴侶功能，影響腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞周期蛋白，激酶等的活性，從而影響到腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為抗凋亡的作用。
　　 通過(guò)影響HSP70而達(dá)到抗腫瘤的作用已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。AliAghdassi等研究HSP70在胰腺癌中的作用證實(shí)HSP70在胰腺癌中較正常細(xì)胞中高表達(dá)且其高表達(dá)阻礙了腫瘤細(xì)胞的凋亡，并發(fā)現(xiàn)選擇性下調(diào)HSP70的表達(dá)能誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)

4、胞的凋亡并能減輕小鼠移植瘤的大小及重量，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在下調(diào)HSP70的過(guò)程中伴隨著凋亡信號(hào)分子caspase-3和caspase-9的激活，認(rèn)為此機(jī)制是HSP70抑制劑的抗腫瘤作用機(jī)制之一。
　　 白藜蘆醇是從多種葡萄屬植物中提取的多酚類化合物，具有抗炎，抗菌，抗腫瘤等作用。白藜蘆醇作為一種化學(xué)預(yù)防劑及心臟保護(hù)制劑日漸受到人們關(guān)注，也有人認(rèn)為其可以直接作為抗腫瘤藥物。Clement等早在1998年就發(fā)現(xiàn)一定劑量的白藜蘆醇可以誘導(dǎo)HL

5、-60細(xì)胞發(fā)生凋亡。PrabirK等最近發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能通過(guò)抑制HSP70的表達(dá)誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，并能增加17-AAG對(duì)K562細(xì)胞的抗腫瘤作用，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能降低細(xì)胞核內(nèi)HSF1的水平而升高胞漿內(nèi)HSF1的水平，這阻止了HSF1的核定位，從而從基因水平下調(diào)HSP70的表達(dá)，這可能是白藜蘆醇抗腫瘤或增敏的主要機(jī)制。
　　 白藜蘆醇對(duì)非霍奇金淋巴瘤的作用國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)旨在研究白藜蘆醇對(duì)非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞raji細(xì)胞系

6、是否具有抗腫瘤作用，并初步探討其抗腫瘤的作用是否因?yàn)橄抡{(diào)HSP70的表達(dá)所致，為進(jìn)一步闡明白藜蘆醇抗淋巴瘤的作用機(jī)制提供依據(jù)。因此本實(shí)驗(yàn)研究分以下兩部分：
　　 1.白藜蘆醇對(duì)非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系raji細(xì)胞增殖及凋亡的影響。
　　 2.HSP70在raji細(xì)胞中的表達(dá)情況及白藜蘆醇對(duì)raji細(xì)胞中HSP70表達(dá)的影響。
　　 第一章：白藜蘆醇對(duì)raji細(xì)胞增殖及凋亡的影響研究
　　 目的：
　　

7、 研究白藜蘆醇對(duì)淋巴瘤raji細(xì)胞增殖及凋亡的影響。
　　 材料與方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)與分組：raii細(xì)胞培養(yǎng)于含10％的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。
　　 2.CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例及分析細(xì)胞周期分布：收集待檢測(cè)細(xì)胞，用FACS流式細(xì)胞儀進(jìn)行雙色熒光細(xì)胞流式計(jì)數(shù)，觀察凋亡細(xì)胞百分比；收集待檢測(cè)細(xì)胞，用流

8、式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布。
　　 結(jié)果：
　　 白藜蘆醇能明顯抑制淋巴瘤raii細(xì)胞的增殖，作用呈現(xiàn)濃度及時(shí)間依賴性，其機(jī)制可能是影響了細(xì)胞周期，造成細(xì)胞周期阻滯；白藜蘆醇能明顯誘導(dǎo)淋巴瘤raji細(xì)胞的凋亡，作用呈現(xiàn)濃度及時(shí)間依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：白藜蘆醇能濃度及時(shí)間依賴性的抑制淋巴瘤raji細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)其凋亡，其抑制增殖的機(jī)制可能是白藜蘆醇導(dǎo)致了細(xì)胞周期阻滯。
　　 第二章：HS

9、P70在raji細(xì)胞中的表達(dá)情況及白藜蘆醇對(duì)其表達(dá)的影響研究
　　 目的：
　　 研究raii細(xì)胞與正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞中HSP70表達(dá)的差異；檢測(cè)白藜蘆醇處理raji細(xì)胞后HSP70表達(dá)的情況。
　　 材料與方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)與分組：raji細(xì)胞培養(yǎng)于含有10％的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。3例健康獻(xiàn)血員外周靜脈血用密度梯度離心法分離得單個(gè)核細(xì)胞為正常對(duì)照組。
　　 raji細(xì)

10、胞先分五組：白藜蘆醇0、40、100、160、250μmol/L處理raji細(xì)胞；后取白藜蘆醇100μmol/L處理raji細(xì)胞后分0h、24h、48h、72h分別用于Westernblot及RT-PCR檢測(cè)；
　　 2.Westernblot檢測(cè)：
　　 2.1檢測(cè)腫瘤細(xì)胞raji細(xì)胞與3份正常外周血淋巴細(xì)胞的HSP70的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。
　　 2.2白藜蘆醇0、40、100、160、250μmol/L處理r

11、aji細(xì)胞后48h用Westernblot檢測(cè)raji細(xì)胞中HSP70的表達(dá)情況。
　　 2.3白藜蘆醇100μmol/L處理raji細(xì)胞后分0h、24h、48h、72h，用Westernblot檢測(cè)HSP70的表達(dá)情況。
　　 3.RT-PCR檢測(cè)：白藜蘆醇100μmol/L處理raji細(xì)胞后分0h、24h、48h、72h，用RT-PCR檢測(cè)HSP70mRNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 淋巴瘤ra