柑桔潰瘍病菌的PCR快速檢測技術(shù)研究.pdf

1、柑桔潰瘍病(Citrus Bacterial Canker Disease,CBCD)是由地毯草黃單胞桿菌柑桔致病變種(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac)引起的一種影響全球柑桔產(chǎn)業(yè)發(fā)展的國內(nèi)外重大檢疫性病害.其主要通過顯癥或帶菌種苗、接穗、果實等柑桔材料的調(diào)運進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播,田間病害主要靠病菌隨風(fēng)夾雨擴(kuò)散,病菌在自然狀態(tài)下的存活期較長.對于該病的檢疫檢驗,除傳統(tǒng)的方法外,近年來國外已發(fā)展了PCR檢驗

2、技術(shù),但現(xiàn)有技術(shù)在特異性和穩(wěn)定性等方面還存在著一些問題,制樣技術(shù)亦繁雜費時,并且國內(nèi)外均無適合實際應(yīng)用的檢測試劑盒研制的報道.中國加入WTO以后,柑桔潰瘍病檢疫的新形勢迫切要求建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的分子診斷和檢驗技術(shù)體系,而國內(nèi)尚無這方面的研究報道.研究目的:該研究通過檢測穩(wěn)定性好、靈敏度高的特異性引物的設(shè)計與篩選,無害化參照體系的構(gòu)建,簡便快速的浸泡制樣技術(shù)研究和常溫貯藏檢測試劑盒的研制,旨在建立起快速準(zhǔn)確而又穩(wěn)定安全的柑桔潰瘍病

3、菌PCR檢測技術(shù)體系,實現(xiàn)大量柑桔樣品的快速檢驗,為柑桔非疫生產(chǎn)區(qū)建設(shè)和病害預(yù)警監(jiān)測提供一種分子檢測技術(shù)和實用工具.研究方法:利用引物和探針設(shè)計軟件Primer Premier 5.0進(jìn)行引物的設(shè)計;通過擴(kuò)增靶片段序列在核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比對的方法和近緣細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法驗證了檢測的特異性;通過對不同濃度的柑桔潰瘍病菌DNA和菌液的PCR擴(kuò)增測定了檢測的靈敏度;通過在不同DNA擴(kuò)增儀和溫度控制方式下的擴(kuò)增程序調(diào)試以及在不

4、同實驗室的驗證測試保證了檢測的穩(wěn)定性.將靶片段與克隆載體連接后,用CaCl<,2>法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(JM109),然后通過測序來驗證PCR擴(kuò)增的正確性;以重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化的大腸桿菌構(gòu)建了無害化參照體系.利用浸泡濃縮法優(yōu)化了制樣技術(shù);采用預(yù)混PCR反應(yīng)液中加入生物活性分子穩(wěn)定劑并冷凍干燥固相化包被處理的方法研制出能常溫貯存的方便有效的檢測試劑盒.利用優(yōu)化的分子檢測體系對四川、廣西、湖南和重慶等地采集的柑桔樣品進(jìn)行了PCR實際檢測,并且部分樣品