柑桔潰瘍病菌外膜蛋白研究.pdf

1、柑桔潰瘍病(citrus canker)是由地毯草黃單胞桿菌柑桔致病變種(Xantho monasaxonopodis pv.citri,Xac)引起的一種細(xì)菌性傳染病害,是危害世界柑桔生產(chǎn)最嚴(yán)重的病害之一,也是影響柑桔生產(chǎn)的重大檢疫病害。地毯草黃單胞桿菌柑桔致病變種(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac)為革蘭氏陰性細(xì)菌,外膜蛋白是革蘭氏陰性菌外膜的重要組成部分之一,在維持細(xì)菌正常的形態(tài)、生理生化、新

2、陳代謝等方面具有重要作用,同時具有免疫原性和保護(hù)性,在致病菌的致病過程也起到非常重要的作用。目前,有關(guān)Xac外膜蛋白的研究比較少,本研究期望通過對Xac外膜蛋白的生物信息學(xué)分析、克隆和表達(dá),了解其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能特點(diǎn),探求其在致病過程中的作用,以期對柑桔潰瘍病的防治作出貢獻(xiàn)。本實驗運(yùn)用生物信息學(xué)工具,對柑桔潰瘍病菌的外膜蛋白一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,獲得外膜蛋白的等電點(diǎn)、分子量、信號肽、結(jié)構(gòu)域和功能等特征。選取具有代表性的Xac的外膜

3、蛋白基因XacOmp4、XacOmp5、XacOmp7及XacOmp12進(jìn)行基因的克隆和重組蛋白表達(dá),并針對XacOmp7的功能進(jìn)行驗證、分析。主要結(jié)果如下:
　　 1、下載Xac蛋白庫,通過生物信息學(xué)工具及在線分析對其分類、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn):Xac外膜蛋白共有40條,分成了20組。Xac外膜蛋白除XacOmp1(1107aa)和XacOmp2(2190aa)外,其余大小在103～503aa之間,18組具有信號肽,15組為

4、酸性蛋白質(zhì),2組蛋白具有跨膜區(qū);Xac外膜蛋白中,OmpW、OmpA、YadA及OEP是主要的功能區(qū)域,占蛋白的65%。此外,.Xac還具有SIP、TolueneX、Lipoprotein及SmpA-OmlA等結(jié)構(gòu)模塊。
　　 2、與Xanthomonas屬其它種的外膜蛋白比對發(fā)現(xiàn),Xac的5組蛋白具有特異性,15組外膜蛋白在Xanthomonas屬中均具有同源蛋白。其外膜蛋白與Xanthomonascampestris pv.

5、vesicatoria(Xcv)的外膜蛋白的同源性最高,所具有的功能性結(jié)構(gòu)域的種類和個數(shù)都比較接近。
　　 3、Xac的外膜蛋白XacOmp4和XacOmp5都具有信號肽和OmpW模塊,分子量都約為22KDa,等電點(diǎn)分別為5.90和6.28,氨基酸的長度分別為204aa和207aa,編碼兩者的基因大小分別為612bp和638bp;XacOmp7的氨基酸長度為446aa,分子量為47KDa,等電點(diǎn)5.18,有信號肽,具有Tolue

6、neX模塊,編碼XacOmp7的基因長度為1338bp;XcaOmp12的氨基酸長度為365aa,分子量為39KDa,等電點(diǎn)為4.63,具有信號肽和OmpA模塊,編碼XacOmp12的基因長度為1095bp。這四個蛋白與Xanthomonas屬其它種外膜蛋白具有較高的同源性。通過對四個蛋白的分析,克隆出了四個蛋白基因,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),成功的表達(dá)了重組蛋白。
　　 4、以甲苯為底物,借助高效液相色譜技術(shù),對外膜蛋白XacOmp7功