抗煙草花葉病毒(TMV)蛋白Y3基因的克隆與原核、真核表達研究.pdf

1、植物病毒病是由植物病毒引起的對農業(yè)生產造成嚴重影響的一類重要病害，目前尚未有高效的抗病毒制劑，尤其是天然抗病毒制劑來防治植物病毒病。研究發(fā)現食用菌中含有許多具有獨特功能的生物活性蛋白，如核糖體失活蛋白（RIP）、抗動植物病毒蛋白、凝集素等，它們具有很強的抗腫瘤、抗動植物病毒、抗真菌、免疫調節(jié)等生物活性，這為日益嚴重的植物病毒病害提供了新的防治途徑。
　　Y3是從食用菌毛頭鬼傘（Coprinus comatus）中發(fā)現的對煙草花葉病

2、毒（Tobacco mosaic virus，TMV）具有一定抑制作用的蛋白，此蛋白呈堿性，在體外穩(wěn)定性高，利于開發(fā)，具有潛在的應用價值。本試驗對其基因序列及原核、真核表達特性進行了研究，其結果如下：
　　(1)通過克隆得到一段1000bp的蛋白y3基因的全長DNA序列和530bp的cDNA序列。利用NCBI中的BLAST同源檢測，發(fā)現DNA序列只有與抗TMV蛋白Y3部分DNA序列有最大的同源性，GenBank登錄號為HM2049

3、31.1，最大同一性（Max identity）為94％；cDNA序列則包括1個最大長度為393 bp的ORF，該最大ORF推測可編碼1個含有130個氨基酸的多肽鏈，將其與NCBI上的蛋白y3部分cDNA序列進行比對，一致性達到95.69%。同時比對y3基因的DNA序列和cDNA序列，發(fā)現二者序列的同一性（Identity）達89.96%，幾乎完全配對，說明本試驗所得到的兩種序列具有很高的同源性，進一步說明本試驗得到的DNA和cDNA序

4、列均是目的序列。
　　(2)設計帶有限制性酶切位點Bamh1和Xho1的引物，以獲得的530bp的cDNA序列為模板進行PCR，再將PCR產物與載體PET28a(+)連接構建原核表達載體PET28a(+)-y3，誘導表達的蛋白經純化后采用半葉法測定其抗病毒活性，表明當y3蛋白濃度為12.5μg/ml時，對TMV侵染抑制率為70.22%＋1.25%，說明本試驗通過原核表達得到的y3蛋白液還是具有比較好的抗TMV活性的，但是低于直接從

5、毛頭鬼傘子實體中提取的y3蛋白的抗TMV活性，說明原核表達系統存在著一定的不足和缺陷，還需要進一步探索更好的蛋白表達系統。
　　(3)以帶有酶切位點 SnaBⅠ和NotⅠ的序列為引物，以獲得的530bp的cDNA序列為模板進行 PCR，將獲得的目的片段與 T-載體連接、轉化、提取后再與真核表達載體pPic9k連接轉化入酵母感受態(tài)細胞，經甲醇誘導表達后得到抗TMV蛋白Y3。通過摸索接種比例、甲醇濃度、pH值、搖床轉速、誘導時間等培養(yǎng)

6、條件對蛋白Y3表達的影響，經過正交試驗優(yōu)化確定了較優(yōu)發(fā)酵條件：將Mut+轉化子接種于BMGY生長培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至OD600=5.0，離心后以1.5:1的接種比例轉移到含有1.0％甲醇，pH值為6.0的BMMY誘導培養(yǎng)基中。300rmp，30℃，誘導培養(yǎng)5天，每隔24h添加1.0％的甲醇。結果表明優(yōu)化后Y3表達量約40.7mg/L，比優(yōu)化前的24.5mg/L提高了將近1倍。目的蛋白經SDS-PAGE電泳，大小約為14.4kD，證明目的蛋白